滾環(huán)擴(kuò)增陽(yáng)離子共軛聚合物均相檢測(cè)microRNA

成永強(qiáng)，賈海蓮，唐志遠(yuǎn)，趙晶晶，李正平

（河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，藥物化學(xué)與分子診斷省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002）

microRNA（miRNA）是細(xì)胞內(nèi)源性非蛋白編碼的小分子RNA（19～24個(gè)堿基）［1］，其表達(dá)水平與人類(lèi)重大疾病密切相關(guān)［2］.miRNA 現(xiàn)已成為一種新的生物標(biāo)記物應(yīng)用于癌癥等重大疾病的早期診斷和治療［3］.例如，研究發(fā)現(xiàn)miR221在結(jié)腸癌、人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，因此，miR221分析對(duì)與其相關(guān)疾病的診斷和治療具有重要意義［4］.但是，由于miRNA 分子小、含量低，許多同源miRNA 序列相似度高，僅差1～2個(gè)堿基，因此，高靈敏度的miRNA 檢測(cè)一般需要特異、高效的擴(kuò)增技術(shù)［5］.

滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amlification，RCA）是近年來(lái)出現(xiàn)的一種高效的擴(kuò)增技術(shù)，它以寡聚核苷酸為引物，以單鏈環(huán)狀DNA，即鎖式探針（Padlock Probe，PLP）為模板，在具有頂替作用DNA 聚合酶的作用下實(shí)現(xiàn)DNA 的高效擴(kuò)增，生成包含若干質(zhì)量復(fù)序列的DNA 長(zhǎng)鏈產(chǎn)物［6］.RCA 技術(shù)應(yīng)用于miRNA 檢測(cè)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：恒溫?cái)U(kuò)增，不需要熱循環(huán)；特異性好，小分子miRNA 正好可以作為環(huán)形DNA 探針成環(huán)的模板，并且所用的酶連接反應(yīng)可精確識(shí)別單堿基錯(cuò)配；擴(kuò)增產(chǎn)物為上百個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的長(zhǎng)鏈DNA，能同時(shí)結(jié)合幾百個(gè)特異標(biāo)記探針，檢測(cè)信號(hào)集中［7］.但是，利用標(biāo)記探針檢測(cè)經(jīng)常需要固相的分析模式，需要多步雜交和洗滌，步驟繁瑣.當(dāng)前，RCA 均相檢測(cè)miRNA 多采用熒光染料與DNA 產(chǎn)物相結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)熒光進(jìn)行檢測(cè)［8］.但由于熒光染料與溶液中的DNA 和RNA 都能結(jié)合，在實(shí)際樣品分析時(shí)易使檢測(cè)的背景值偏高.

本文中，為了降低RCA 反應(yīng)均相檢測(cè)miRNA 的背景值，提高檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)克服標(biāo)記探針固相分析的不足，筆者首先使熒光標(biāo)記探針與長(zhǎng)鏈DNA 產(chǎn)物雜交，然后，加入陽(yáng)離子共軛聚合物（catiomic conjugated polymer，CCP），其與DNA 產(chǎn)物可通過(guò)靜電力作用結(jié)合，同時(shí)與雜交的熒光標(biāo)記探針發(fā)生高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy ransfer，F(xiàn)RET）［9］；未雜交的單鏈熒光標(biāo)記探針應(yīng)用Exo I水解成單核苷酸，其與CCP相互作用力弱，不能發(fā)生有效的FRET，無(wú)需分離和洗滌步驟，可實(shí)現(xiàn)RCA 擴(kuò)增miRNA 的均相、特異檢測(cè).方法與非特異熒光染料相比，可有效降低均相檢測(cè)miRNA 的背景值.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

F4500熒光分光光度計(jì)（Hitachi，日本）；2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems，USA）；Phi29 DNA 聚合酶、ExoΙ（Epicenter Biotechnologies，USA）；T4RNA ligase2（New England Biolabs，USA）；實(shí)驗(yàn)選用miR221作為研究的目標(biāo)miRNA，所有合成的寡聚核苷酸引物及miR221序列（表1）、脫氧核苷三磷酸的混合物（dNTPs）、Ribonuclease Inhibitor和焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水購(gòu)自大連寶生物科技有限公司（Takara，Dalian）；4－（2－h(huán)ydroxyethyl）－1－piperazineethanesulfonic acid（HEPES）購(gòu)自Sigma.所用陽(yáng)離子共軛聚合物（CCP）為poly［（9，9－bis（6－N，N，N－trimethylammonium）hexyl）fluorenylenephenylenedibromide］（PFP）購(gòu)自常州欣宏科生物化學(xué)有限公司.實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為DEPC處理過(guò)的超純滅菌水.

表1 實(shí)驗(yàn)所用寡聚核苷酸引物及miRNA序列（5′－3′）Tab.1 Sequences of probes and miRNA used in the experiments（5′－3′）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鎖式探針的連接成環(huán)反應(yīng)

在200μL的PCR 管中加入0.5μL 的10×T4RNA Ligase2緩沖溶液，其中含有500mmol／L Tris－HCl，pH 為7.5，20mmol／L的MgCl2，10mmol／L 的二硫蘇糖醇（DTT），4mmol／L 的ATP.再加入1μL的200nmol／L的PLP 探針溶液，0.5μL的40U／L Ribonuclease Inhibitor，適量的miR221溶液，加DEPC處理水至6μL，加熱到55℃保存3min.然后在37℃保持20min.加入3U 的T4RNA Ligase2，0.5μL的10×T4RNA Ligase2緩沖溶液和DEPC處理水至終體積為10μL，于37 ℃連接成環(huán)50min.反應(yīng)完后，在溶液中加入40U 的ExoⅠ，于37 ℃保持60min，在80 ℃溫育15min，以失活ExoⅠ.

1.2.2 RCA 反 應(yīng)

在連接反應(yīng)溶液中，加入10μL 的Phi29DNA 聚合酶反應(yīng)溶液，其中包括：200mmol／L 的Tris－HCl，250mmol／L的KCl，50mmol／L 的MgCl2，25mmol／L 的（NH4）2SO4，20mmol／L 的DTT，1.25mmol／L的dNTPs，30U 的phi29DNA 聚合酶，在30 ℃下進(jìn)行RCA 反應(yīng)4h，于75 ℃溫育5min，失活phi29DNA聚合酶.

1.2.3 RCA 產(chǎn)物的熒光檢測(cè)

取RCA 產(chǎn)物9μL，加入2μL的2μmol／L熒光標(biāo)記DNA 探針，混勻后在70 ℃下保持3min，于37 ℃雜交45min.反應(yīng)完后加入20U 的ExoΙ，在37 ℃保持60min，80 ℃溫育15min，失活ExoⅠ.

在500μL的離心管內(nèi)加入194μL 的HEPES溶液（25mmol／L，pH＝7.8），4μL 的雜交產(chǎn)物和2μL的15μmol／L PFP溶液，總體積為200μL.應(yīng)用F－4500熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為380nm，掃描波長(zhǎng)為400～600nm 下進(jìn)行測(cè)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 RCA 反應(yīng)均相檢測(cè)miRNA 原理

利用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合陽(yáng)離子共軛聚合物熒光共振能量轉(zhuǎn)移均相檢測(cè)miRNA 的原理如圖1所示.設(shè)計(jì)的PLP探針首先以目標(biāo)miRNA 分子（miR221）為模板，在T4RNA ligase2的作用下連接成環(huán).T4RNA ligase2在以miRNA 為模板連接DNA 探針時(shí)具有很好的特異性［7］，而且能高效地催化連接3′端有2 個(gè)RNA 堿基修飾5′端磷酸化修飾的DNA 引物［10］.因此，為了提高連接效率，設(shè)計(jì)PLP 探針的3′端有2 個(gè)RNA 堿基修飾.未成環(huán)的線(xiàn)性PLP探針用ExoΙ降解，以防止其影響后面的RCA 和標(biāo)記探針的雜交反應(yīng).當(dāng)加入Phi29DNA 聚合酶反應(yīng)溶液，miRNA 分子可直接作為引物引發(fā)RCA 反應(yīng)，生成具有上百重復(fù)序列的長(zhǎng)鏈DNA 產(chǎn)物.然后，在RCA 產(chǎn)物溶液加入與長(zhǎng)鏈DNA 產(chǎn)物序列互補(bǔ)的熒光素標(biāo)記探針，使其充分雜交.而溶液中未雜交的過(guò)量熒光素標(biāo)記探針利用ExoΙ降解成單核苷酸分子.當(dāng)在產(chǎn)物溶液中加入陽(yáng)離子共軛聚合物（PFP）時(shí)，由于其陽(yáng)離子骨架可與核酸分子通過(guò)強(qiáng)靜電力結(jié)合，并且長(zhǎng)鏈的共軛分子結(jié)構(gòu)具有特殊的光學(xué)和電化學(xué)性能，具有優(yōu)良的光捕獲性質(zhì)和信號(hào)放大能力［11］，PFP 與熒光標(biāo)記的DNA 產(chǎn)物通過(guò)靜電力作用相結(jié)合，能發(fā)生強(qiáng)烈的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）.而被降解的熒光素標(biāo)記單核苷酸分子電荷小，其與PFP作用較弱，距離較遠(yuǎn)，二者之間不能發(fā)生有效的FRET.因此，根據(jù)FRET 效率的大小可以實(shí)現(xiàn)RCA 擴(kuò)增miRNA 的均相檢測(cè).

圖1 RCA反應(yīng)陽(yáng)離子共軛聚合物均相檢測(cè)miRNA原理Fig.1 Principle of homogeneous detection of miRNA by RCA and CCP

圖2為miRNA（miR221）樣品與空白溶液經(jīng)RCA 反應(yīng)后應(yīng)用PFP檢測(cè)的熒光光譜圖.從圖2曲線(xiàn)a可見(jiàn)，目標(biāo)miR221分子的反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜在PFP的熒光峰（λem＝420nm）處降低.同時(shí)，熒光素分子的熒光發(fā)射峰（λem＝525nm）顯著增強(qiáng)，表明發(fā)生了PFP到熒光素分子的能量轉(zhuǎn)移.目標(biāo)miR221可使PLP成環(huán)并引發(fā)RCA 反應(yīng)，產(chǎn)生的DNA 長(zhǎng)鏈上雜交了多個(gè)熒光素標(biāo)記的DNA 探針.在加入PFP 后，其能與DNA分子通過(guò)靜電力作用相互吸引，PFP作為能量供體把能量轉(zhuǎn)移到DNA 上標(biāo)記的熒光素分子上，產(chǎn)生高效的FRET.而在空白溶液中（曲線(xiàn)b），在525nm 熒光素的熒光強(qiáng)度很低，同時(shí)420nm 處PFP的熒光值高于樣品的熒光值，其FRET 效率（I525nm／I420nm）顯著比miR221產(chǎn)生的低.這是由于在空白溶液中，不能發(fā)生連接成環(huán)反應(yīng)，亦不能引發(fā)RCA 反應(yīng).單鏈熒光素標(biāo)記探針被ExoΙ消化降解為單核苷酸小分子，其電荷小，與PFP的結(jié)合能力弱，不能產(chǎn)生有效的FRET.據(jù)此，筆者優(yōu)化了反應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件，建立了RCA 擴(kuò)增均相檢測(cè)miRNA 的新方法.

圖2 miRNA的RCA反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用PFP檢測(cè)的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra from solution containing PFP and RCA products from miRNA

2.2 熒光標(biāo)記探針濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，鎖式探針濃度和PFP的用量等反應(yīng)條件對(duì)結(jié)果影響較小.而熒光標(biāo)記探針的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，需進(jìn)行優(yōu)化.

圖3 熒光標(biāo)記探針的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響Fig.3 Effect of concentration of fluorescein－labeled probe on the experimental results

熒光標(biāo)記探針的用量對(duì)PFP引起的FRET 效率（I525nm／I420nm）有著較大影響，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了不同用量熒光標(biāo)記探針對(duì)FRET 效率的影響.圖3為熒光標(biāo)記探針的濃度分別為105，200，364，500nmol／L 時(shí)，空白和樣品的FRET 效率情況.如圖3所示，miRNA 的反應(yīng)產(chǎn)物的FRET 效率隨熒光標(biāo)記探針濃度升高而顯著提高.當(dāng)超過(guò)364nmol／L時(shí)，F(xiàn)RET 效率提高并不明顯，表明熒光標(biāo)記探針濃度為364nmol／L 時(shí)，其與RCA產(chǎn)物進(jìn)行充分雜交，F(xiàn)RET 效率最大；而加入濃度再增加時(shí)，過(guò)量的標(biāo)記探針會(huì)被ExoΙ降解消化掉，F(xiàn)RET效率幾乎保持不變.因此，實(shí)驗(yàn)選擇364nmol／L為最佳熒光標(biāo)記探針用量.

2.3 方法的校準(zhǔn)曲線(xiàn)和靈敏度

在最佳熒光標(biāo)記探針用量，RCA 反應(yīng)4h的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)量了不同濃度miR221的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率.如圖4所示，miR221的濃度在0.5～100pmol／L 內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)FRET 效率隨其濃度的增加而增強(qiáng).并且，相對(duì)FRET 效率與miR221濃度在0.5～20pmol／L內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（圖4插圖）.線(xiàn)性方程為Y＝1.928＋2.513cmiR221（pmol／L），Y 為相對(duì)FRET 效率.相關(guān)系數(shù)R＝0.997 8，檢出限（3σ，n＝11）為0.2pmol／L.對(duì)10pmol／L的miR221重復(fù)測(cè)定5次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4%.

圖4 相對(duì)FRET效率與目標(biāo)miR221不同濃度的關(guān)系Fig.4 Relationship between the relative FRET efficiency and the concentration of target miR221

3 結(jié)論

提出了一種利用滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)合陽(yáng)離子共軛聚合物的熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)均相檢測(cè)miRNA 的新方法.方法針對(duì)通常標(biāo)記探針必須用固相檢測(cè)方式的不足，在熒光標(biāo)記探針與RCA 產(chǎn)物雜交后，使用單鏈特異核酸外切酶I降解過(guò)量的熒光標(biāo)記探針.然后，利用陽(yáng)離子共軛聚合物PFP與熒光標(biāo)記探針產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)了RCA 反應(yīng)標(biāo)記探針的均相檢測(cè).同時(shí)，基于PFP 獨(dú)特的光學(xué)特性，可進(jìn)一步提高目標(biāo)miRNA 檢測(cè)的靈敏度.方法簡(jiǎn)便，背景低，靈敏度高，不需要繁瑣的分離和精確的控溫步驟.方法可為miRNA 及DNA 等的均相RCA 檢測(cè)和原位成像分析以及臨床診斷提供一種新策略.

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