乳酸菌降解亞硝酸鹽的發(fā)酵條件研究

顧詩雯，何婷婷，2，丁少南，2，龔鋼明，*

（1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

乳酸菌有促進(jìn)營養(yǎng)分解、吸收，抑制腸道腐敗菌生長，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡降膽固醇，降血壓，抗腫瘤等保健功能，是人體健康的益生菌，在傳統(tǒng)食品及功能性食品加工中有著廣泛的應(yīng)用。乳酸菌在發(fā)酵過程中還可產(chǎn)生一些特殊酶系[1-2]，例如亞硝酸鹽還原酶，它可以催化亞硝酸鹽還原。食品中如果亞硝酸鹽殘留超標(biāo)可存在致癌的危害，當(dāng)前，由于大量含氮化肥使用以及工業(yè)廢水的排放與灌溉，使不少蔬菜中亞硝酸鹽殘留污染較高。利用乳酸菌控制食品中亞硝酸鹽殘留超標(biāo)已引起研究者關(guān)注。張慶芳等[3-4]對乳酸菌降解亞硝酸鹽機(jī)理的研究認(rèn)為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸及亞硝酸還原酶都能起著降解亞硝酸鹽的作用。夏巖石等[5]比較了自然發(fā)酵與乳酸菌接種發(fā)酵豆角過程中降解亞硝酸鹽的動態(tài)，分析了不同發(fā)酵溫度和起始pH 條件下發(fā)酵液亞硝酸鹽含量的變化。周光燕等[6]研究了乳酸菌對泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化。研究結(jié)果都表明乳酸菌有明顯降解亞硝酸鹽的效果。

乳酸菌發(fā)酵降解亞硝酸鹽的影響因素較多，例如菌種、接種量、發(fā)酵溫度、起始pH、發(fā)酵時間、培養(yǎng)基成分等。目前，相關(guān)的研究還比較少。本文以番茄汁作為培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)設(shè)計研究番茄汁與水的比例，NaCl 添加量，培養(yǎng)時間，所接菌種與亞硝酸鹽降解的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于乳酸菌發(fā)酵蔬菜汁工藝中亞硝酸鹽殘留的控制與消除提供一定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

材料：番茄（市售）；酪蛋白胨；牛肉膏；酵母粉；葡萄糖；均為生化試劑，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乙酸鈉；檸檬酸二胺；吐溫80；K2HPO4；MgSO4·7H2O；MnSO4·H2O；CaCO3；瓊脂；硼酸鈉；乙酸鋅；亞鐵氰化鉀；鹽酸萘乙二胺；對氨基苯磺酸；亞硝酸鈉均為分析純購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PHSJ-4A 型PH 計：上海大中分析儀器廠；HH-S型水浴鍋：金壇市岸頭國瑞實(shí)驗(yàn)儀器廠；SYQ-DSX-280 型滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SHP-150 型CO2恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏設(shè)備有限公司。

菌種：短乳桿菌（Lactobacius brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）由上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)學(xué)院分離并保存。

1.2 培養(yǎng)基

MRS 液體培養(yǎng)基：酪蛋白胨10.0 g；牛肉膏10.0 g；酵母粉5.0 g；葡萄糖5.0 g；乙酸鈉5.0 g；檸檬酸二胺2.0 g；吐溫80 1.0 g；K2HPO42.0 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；MnSO·4H2O 0.05 g；CaCO320.0 g。去離子水：1 000 mL，調(diào)節(jié)pH7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20 min（pH 測定采用PHSJ-4A 精密pH 計）。

番茄汁培養(yǎng)基：取新鮮番茄，洗凈，于95 ℃水中熱燙3 min，去皮，用組織搗碎機(jī)打漿，用2 層紗布過濾，所得濾液與適量蒸餾水混合后即得到番茄汁，與一定比例的蒸餾水混合，調(diào)節(jié)pH 至6.5，再加熱至90 ℃保持30 min，得番茄汁培養(yǎng)基，冷卻后備用。

1.3 菌種活化與培養(yǎng)

取菌種按4%接種量接種于裝有200 mLMRS 液體培養(yǎng)基250 mL 錐型瓶中，置培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)20 h，得到種子菌種，備用。

1.4 番茄汁發(fā)酵培養(yǎng)

取250 mL 錐型瓶中加入200 mL 番茄汁培養(yǎng)基，再加入一定量的NaCl，接入相應(yīng)的菌種，接種量為4 %，放置恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)20 h，取出調(diào)pH 至6.5，加入一定量NaNO2，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)一定的時間，取樣測定NaNO2的量。

1.5 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

稱取0.100 g 亞硝酸鈉于干燥器中干燥24 h，置入500 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻后從中取出5.00 mL，置于200 mL 容量瓶中，加水蒸餾水至刻度，得亞硝酸鈉母液。分別吸取亞硝酸鈉母液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 置 于50 mL 容量瓶中，各加入40 mL 蒸餾水，和2 mL 對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再各加入1 mL 鹽酸萘乙二胺溶液，混勻后加水至刻度，避光靜置15 min，于540 nm 處測吸光值。以橫坐標(biāo)為NaNO2的含量，縱坐標(biāo)為吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.6 樣品測定

取5.0 mL 發(fā)酵液，置于250 mL 三角瓶中，加入12.5 mL 飽和硼砂液，攪拌均勻，再加入40 mL 蒸餾水，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫后加入5 mL 亞鐵氰化鉀溶液，混勻后加入5 mL 乙酸鋅溶液，混勻，靜置30 min，轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻。過濾，收集濾液。取2.00 mL 濾液于50 mL 容量瓶中，加入40 mL 水，再加入2 mL 對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再加入1 mL 鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，加水至刻度，避光靜置15 min，在540 nm 處測吸光值，另以5.0 mL 蒸餾水代替樣品液，做空白對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品NaNO2的含量[7]。

1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選NaCl 添加量、番茄汁∶水、培養(yǎng)時間、乳酸菌菌種為影響因素，以亞硝酸鹽降解率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。每個因素選擇3 個水平，用L9（34）正交表設(shè)計進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平表Table 1 orthogonal factors and levels table

乳酸菌發(fā)酵液中NaNO2降解率按以下公式計算：

NaNO2降解率=（初始培養(yǎng)時NaNO2的含量-培養(yǎng)一定時間后NaNO2的含量）/（初始培養(yǎng)時NaNO2的含量）×100%

1.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)選擇的最佳提取工藝條件，重復(fù)進(jìn)行3 次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并測定亞硝酸鹽降解率，評價正交試驗(yàn)選擇的工藝條件是否穩(wěn)定。從而得到最優(yōu)化的發(fā)酵條件組合。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得曲線方程為：

2.2 正交試驗(yàn)

按照表1 正交設(shè)計因素水平表進(jìn)行乳酸菌番茄汁發(fā)酵。檢測NaNO2含量變化求得NaNO2降解率。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

極差分析結(jié)果表明，各因素對乳酸菌降解亞硝酸鹽的影響程度從高到低的次序?yàn)锽＞C＞D＞A，即NaCl添加量＞培養(yǎng)時間＞菌種＞番茄汁∶水。最佳發(fā)酵工藝條件為A2B2C2D3。即NaCl 添加量4%，培養(yǎng)時間18 h，接菌種為4%植物桿菌，番茄汁∶水為1 ∶1 的條件。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由從表2 可以看出NaCl 的添加量對于番茄汁發(fā)酵產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的量有顯著影響，這可能是因?yàn)镹a+的存在與亞硝酸鹽還原酶的活性有一定關(guān)系，但是NaCl 濃度不能過高，否則會降低NaNO2的降解率，這與張慶芳等的文獻(xiàn)報導(dǎo)相符[8]。關(guān)于NaCl 對乳酸菌具體情況需要進(jìn)一步研究。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)選擇的最佳發(fā)酵條件，即A2B2C2D3的組合重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果是乳酸菌番茄汁發(fā)酵對NaNO2的平均降解率為92.08 %。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計法，以番茄汁為培養(yǎng)基，研究了番茄汁與水比例、NaCl 添加量、培養(yǎng)時間、發(fā)酵菌種對乳酸菌發(fā)酵降解亞硝酸鹽的影響。實(shí)驗(yàn)確定了各因素次的主次順序?yàn)镹aCl 添加量＞培養(yǎng)時間＞菌種＞番茄汁∶水。最佳發(fā)酵工藝條件是NaCl 添加量4%，培養(yǎng)時間18 h，菌種為的短乳桿菌，接種量4%，番茄汁∶水為1 ∶1。在此條件下進(jìn)行了3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示乳酸菌番茄汁發(fā)酵對NaNO2的平均降解率為92.08%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入研究乳酸菌降解亞硝酸鹽的發(fā)酵條件及探索純種發(fā)酵蔬菜汁工藝提供參考。

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