響應(yīng)面優(yōu)化超聲酶法提取石榴花中黃酮類物質(zhì)

史曉華

（山東職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250104）

黃酮類物質(zhì)對(duì)人體的九大系統(tǒng)有顯著影響，能夠直接影響內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，其原因是它是小分子量化合物，且能夠順利通過(guò)人體的保護(hù)系統(tǒng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的影響。隨著對(duì)該類物質(zhì)研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)人類必需的微量營(yíng)養(yǎng)素可能包括部分該類物質(zhì)。擁有著兩千多年栽培記錄的石榴是小喬木的一種，它不僅具有觀賞價(jià)值，而且文化底蘊(yùn)豐厚，最重要的是石榴身上每一個(gè)地方都是寶，尤其是石榴花，加之我國(guó)每年有超過(guò)38 萬(wàn)多噸的石榴產(chǎn)量[1-4]，因而對(duì)其研究將成為一個(gè)充滿前景且富有挑戰(zhàn)的課題。本文重點(diǎn)對(duì)石榴花中黃酮類物質(zhì)的提取進(jìn)行初探，尋求一種最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴花、蘆丁、香草醛、鐵氰化鉀、硅膠G、羧甲基纖維素鈉；纖維素酶：購(gòu)于Novozymes；其他試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備

BARTORIUS AG 電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；JA1003 電子天平：上海奧陽(yáng)衡器有限公司；MYDK-98-ⅡA（單列兩孔）恒溫水浴鍋：上海摩億儀器設(shè)備有限公司；電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電爐；超聲波破碎儀：南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式低速離心機(jī)：上海摩億儀器設(shè)備有限公司；UV-7501 紫外可見分光光度計(jì)：北京中西化玻儀器有限公司；90-2 恒溫定時(shí)磁力攪拌器：上海精科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法[5-11]

制作工藝：干石榴花→分選→干燥→粉碎→確定最佳工藝參數(shù)試驗(yàn)→酶合超聲提取→響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)→薄層層析分離→紫外分光光度法測(cè)含量→計(jì)算提取率

1.4 操作要點(diǎn)

1.4.1 石榴花粉的制備

取優(yōu)選出的石榴花置于干燥箱中，干燥約4 h，然后將其在研缽中迅速研磨成粉，置于干燥的環(huán)境中，備用。

1.4.2 酶解

分別將用電子天平精確稱取的石榴花粉1.00 g、一定量的纖維素酶和10 mL 蒸餾水加入100 mL 燒杯中，混勻后將燒杯放入水浴鍋酶解一段時(shí)間。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定纖維素酶的最佳添加量和最佳T酶解。

1.4.3 纖維素酶高溫滅活

取300 mL 左右的自來(lái)水加入1 000 mL 的大燒杯中，放在電爐子上加熱5 min，將水浴后的燒杯連同溶液一起放入大燒杯中，繼續(xù)加熱至大燒杯中的水沸騰，確保纖維素酶滅活完全。

1.4.4 超聲波處理

將裝有樣品的燒杯冷卻至室溫后，加入80%的乙醇溶液10 mL，搖勻，進(jìn)行超聲波處理。該實(shí)驗(yàn)中將超聲波處理時(shí)間作為單因素進(jìn)行考察。詳細(xì)操作見結(jié)果與討論。

1.4.5 離心

將離心機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為1.1×104r/min，離心25 min，然后將傾出上清液，放入冰箱備用。

1.4.6 黃酮類物質(zhì)提取率η 的測(cè)定

提取后用體積比為1.7 ∶3.8 ∶7.9 ∶5.9 的甲酸、甲醇、乙酸乙酯、氯仿展開劑進(jìn)行層析分離，然后利用紫外-可見分光光度法根據(jù)其吸光度換算含量，計(jì)算出黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量（m）。

式中：M 為樣品液黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量，mg；η 為石榴花中黃酮類物質(zhì)提取率，%；M 為石榴花干重，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定最佳工藝參數(shù)

2.1.1 酶添加量的確定

稱取干石榴花粉末1.00 g，T酶解為60 min，T超聲20 min，改變酶的添加量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 M酶添加量對(duì)黃酮類物質(zhì)提取率的影響Fig.1 The impact on adding amount of enzymes of extraction rate of flavonoids

由圖1 可以看出，在適當(dāng)范圍內(nèi)，黃酮類物質(zhì)提取率會(huì)隨著酶添加量的增加而增加。酶用量的增加可以使細(xì)胞壁破壞的更快，加快黃酮類物質(zhì)的傳遞；但是酶用量足以破壞所有的細(xì)胞壁時(shí)，酶的增加將不會(huì)提高提取率；同時(shí)由于纖維素酶作用提高糖濃度反而使黃酮類物質(zhì)提取難度加大，一定程度降低提取率。從圖中可以看出，該物質(zhì)的提取率達(dá)到最高時(shí)，所用的酶量為0.05 g，所以，酶添加量為0.04 g～0.06 g 時(shí)，為酶合超聲提取實(shí)驗(yàn)的最佳酶添加量取值范圍。

2.1.2 酶解時(shí)間的確定

稱取干石榴花粉末1.00 g，M酶添加量為0.05 g，T超聲20 min，改變T酶解，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 T酶解對(duì)黃酮類物質(zhì)提取率的影響Fig.2 The impact on enzymatic time of extraction rate of flavonoids

由圖2 可以看出，隨T酶解的延長(zhǎng)，更多的酶與細(xì)胞壁作用，提取率逐漸升高；當(dāng)所有的酶都已經(jīng)發(fā)揮作用時(shí)，T酶解的延長(zhǎng)不僅不會(huì)提高提取率，反而黃酮類物質(zhì)被分解而降低提取率。當(dāng)提取率達(dá)到最高43.70%時(shí)，T酶解為60 min，所以，在本實(shí)驗(yàn)中T 酶解為50 min～70 min 時(shí)，是最佳取值范圍。

2.1.3 超聲時(shí)間的確定

稱取干石榴花粉末1.00 g，M酶的添加量為0.05 g，T酶解為60 min，改變T超聲，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象如下圖3 所示。

圖3 T超聲對(duì)黃酮類物質(zhì)提取率的影響Fig.3 The impact on ultrasonic time of extraction rate of flavonoids

由圖3 可以看出，在一定范圍內(nèi)提取率隨T超聲的延長(zhǎng)而提高，此時(shí)超聲波會(huì)更多的破壞細(xì)胞壁而加快黃酮類物質(zhì)的傳質(zhì)；當(dāng)超聲波足以破壞所有的細(xì)胞壁時(shí)，保護(hù)層受到破壞進(jìn)而使黃酮類物質(zhì)遭到破壞，從而降低黃酮類物質(zhì)的量。T超聲在20 min 時(shí)，石榴花中的黃酮類物質(zhì)的提取率最高為44.90%，酶合超聲提取的最佳T超聲范圍為15 min～25 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)[12]

本試驗(yàn)的水平因素表見下表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal experiment level of form factors

根據(jù)已經(jīng)得出的最佳范圍，采用mintab 15 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。選取M酶添加量、T酶解和T超聲為三個(gè)單因素對(duì)干石榴花中黃酮類物質(zhì)提取率進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳的提取工藝。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and experimental results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 The analysis of varianceof regression model

2.3 回歸模型的檢驗(yàn)

在回歸模型中，T酶解X1、T超聲X2和M酶X3為影響因子，提取率Y 為項(xiàng)目指標(biāo)，該模型為：

圖4 各因素交互作用對(duì)提取黃酮類物質(zhì)的影響Fig.4 The interaction of various factors on the impact of the extraction of flavonoids

通過(guò)對(duì)上面的公式做方差分析，得到0.96（R2），0.91（離均差），進(jìn)行LM 回歸分析優(yōu)化后模型的系數(shù)檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，各系數(shù)顯著性比響應(yīng)面優(yōu)化前均要好許多，顯著性水平比較理想。

表4 LM 回歸分析優(yōu)化后模型的系數(shù)檢驗(yàn)Table 4 LM regression coefficient test optimization model

由RSREG Procedure 分析得到一個(gè)極值點(diǎn)，該點(diǎn)為X1=0.131 3、X2=0.939 4、X3=0.515 2，即M酶的添加量為0.05 g，T酶解為60 min 和T超聲為20 min 時(shí)提取率最高。

3 結(jié)論

石榴花中黃酮類物質(zhì)的提取率與T酶解，T超聲和M酶添加量有著直接的關(guān)系，我們可以通過(guò)試驗(yàn)得到，T酶解在50 min 到70 min，T超聲在15 min 到25 min，M酶添加量在0.04 g 到0.06 g 這個(gè)范圍內(nèi)時(shí)，黃酮具有較高的提取率，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析法的優(yōu)化，得到超聲20 min、酶解60 min、加0.05 g 酶時(shí)，可以使1.00 g 干石榴花中黃酮類物質(zhì)獲得最高的提取率，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終獲得石榴花中黃酮類物質(zhì)提取率最高為60.49%。

[1]王超萍.石榴花活性物質(zhì)提取分離技術(shù)研究[D].山東濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院,2011

[2]張立華,孫曉飛,張艷俠,等.石榴花化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(3)：33-35,50

[3]胡淳淳,邵建柱,徐繼忠.不同石榴品種及器官多酚含量的比較研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,33(2)：17-20

[4]蔡建秀,黃艷艷,許婉珍.烏蕨黃酮類類物質(zhì)薄層層析及紫外光譜研究[N].泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005,23(6)：82-85

[5]范菁華.超聲波輔助提取花椒葉總黃酮及其體外抗氧化研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2010

[6]祈乃喜,何翠翠,李建新.升麻總黃酮含量測(cè)定方法研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(9)：17-19

[7]Kaur G,Jabbar Z,Athar M,et al.Punica granatum(pomegranate)flower extract potent antioxidant activity and abrogates Fe—NTA induced hepatotoxicity in mice[J].Food and Chemical Toxicology,2006,44(7)：984-993

[8]易中宏,鄭一敏,胥秀英,等.分光光度法測(cè)定茯苓中總黃酮類成分的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2005,16(9)：847-848

[9]索金玲,彭秧,張縱圓,等.石榴葉總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究[J].生物技術(shù),2009,19(1)：65-63

[10]孫宏,張澤.分光光度法測(cè)定白樺黃酮類物質(zhì)總量[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005,29(1)：110-112

[11]王江海.薄層色譜一光度法測(cè)定靈芝孢子油中的總黃酮含量[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2004,4(3)：76-78

[12]易建華,朱振寶.響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取芹菜黃酮工藝研究[J].食品科學(xué),2009,30(10)：94-96