響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥蜂花粉中黃酮類物質(zhì)的提取

趙娟娟

（衡水學院 生命科學系，河北衡水 053000）

黃酮類化合物是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素。它在植物界分布很廣，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的形式存在，具有抗菌及抗病毒，抗腫瘤，抗氧化自由基，抗炎、鎮(zhèn)痛，保肝護肝等多種生物活性[1]。

蜂花粉中的黃酮主要以游離態(tài)黃酮苷元存在，其中蕎麥蜂花粉內(nèi)黃酮含量較高，從中提取黃酮類化合物無毒、安全，是一種優(yōu)良的黃酮潛在資源[2]。對蕎麥蜂花粉黃酮類物質(zhì)提取工藝條件進行了研究，并取得了較好的效果，為蕎麥蜂花粉的開發(fā)利用提供參考。

1 材料和設(shè)備

1.1 材料

蕎麥蜂花粉：市售；95%乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純：衡水瑞豐化學試劑公司。

1.2 設(shè)備

UVmini-1240 紫外可見分光光度計：日本島津；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；FA1004N電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 蕎麥蜂花粉黃酮產(chǎn)品制備的工藝流程

蕎麥蜂花粉→預處理→乙醇浸提→用紫外分光光度計測黃酮類物質(zhì)的含量

2.2 蕎麥蜂花粉黃酮含量的測定方法

提取液0.5 mL 加5%亞硝酸鈉0.3 mL，混勻放置6 min 加硝酸鋁0.3 mL，混勻放置6 min 加4%的氫氧化鈉4 mL，再向其中加30%的乙醇溶液補足至10 mL，測定波長為510 nm，以30%的乙醇作為標樣進行吸光度的測定[3-4]。

2.3 提取率的測定方法

將處理好的蕎麥蜂花粉多次浸提，直至提取液吸光度基本為零，可認為黃酮類物質(zhì)全部提出。分別收集各級提取液并測定其體積（V，mL）和吸光度值（A）。

式中：V 為提取液體積；A 為提取液稀釋后的吸光度。

2.4 蕎麥蜂花粉中黃酮類物質(zhì)的提取

2.4.1 單因素試驗

以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間為單因素，考察各因素對黃酮類物質(zhì)提取率的影響。

2.4.2 響應(yīng)面試驗

根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理，以蕎麥蜂花粉中黃酮類物質(zhì)提取率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平共15 個試驗點的響應(yīng)面分析試驗。試驗1-12 為析因試驗，13-15 為中心試驗[5-6]。響應(yīng)面試驗設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken 實驗設(shè)計Table 1 Factors and levels in Box-Behnken central composite design

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 乙醇濃度的確定

在料液比為1 ∶20，溫度為70 ℃條件下，分別加入不同濃度乙醇（60%、70%、80%、90%）浸提1.5 h。乙醇濃度對提取效果的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.1 Effect on extracted result of ethanol concentration

由圖1 可以看出，隨著乙醇濃度上升，吸光度逐漸升高，乙醇濃度達到80%以后，其吸光度呈逐漸下降趨勢。因此，選擇80%乙醇溶液提取。

3.1.2 料液比的確定

在醇濃度為80%，提取溫度70 ℃條件下，以不同料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30）浸提1.5 h。料液比對提取效果的影響見圖2。

圖2 料液比對提取效果的影響Fig.2 Effect on extracted result of ratio between material and liquid

由圖2 可知，料液比太小難以保證原料中的黃酮全部轉(zhuǎn)移到液相中，提取率較低。但料液比過大不僅消耗大量溶劑，而且后續(xù)濃縮耗時耗能。由此選擇料液比為1 ∶20。

3.1.3 提取溫度的確定

在乙醇濃度為80%，料液比為1 ∶20 條件下，不同溫度（50、60、70、80 ℃）提取1.5 h。溫度對提取效果的影響見圖3。

由圖3 可知，50 ℃至70 ℃之間隨著溫度的升高黃酮的吸光度增加顯著，在70 ℃達到最高。當溫度過高，造成細胞中有其他雜質(zhì)溶出，導致吸光度下降，因此選擇在70 ℃下提取。

圖3 溫度對提取效果的影響Fig.3 Effect on extracted result of temperature

3.1.4 提取時間的確定在乙醇濃度為80%，料液比為1 ∶20，溫度為70 ℃條件下，分別提取不同時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）。提取時間對提取效果的影響見圖4。

圖4 提取時間對提取效果的影響Fig.4 Effect on extracted result of time

由圖4 可知，提取時間在0.5 h～1 h 吸光度呈急速上升趨勢，1 h～3 h 吸光度呈平緩略升趨勢。平緩說明提取已接近平衡，且略升度較小，從工業(yè)角度考慮為節(jié)省時間應(yīng)選擇1 h 為提取時間，可進行多次提取。

3.2 響應(yīng)面試驗分析結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Experimental results of BOX-Behnken

根據(jù)表2 的試驗結(jié)果，通過SAS 軟件處理將各因素回歸擬和后得到回歸方程。該試驗的回歸方程為Y=0.886 956+0.037 516·X1+0.023 434·X2+0.005 53·X3-0.090 421·X1·X1-0.002 165·X1·X2+0.004 381·X1·X3-0.050 973·X2·X2-0.029 326·X2·X3-0.052 376·X3·X3

3.2.2 回歸方程的方差分析

采用SAS RSREG 程序?qū)Ρ? 數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，分析結(jié)果見表3。

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

該方程回歸顯著，模型的R2=95.85%，說明回歸方程的擬合程度良好。由表3 中的P 值可知道，方程中X1，X1X1，X2X2，X3X3對Y 值的影響達極顯著水平，X2，X2X3對Y 值影響達顯著水平。表明試驗因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項對相應(yīng)值也有很大的關(guān)系。交互項系數(shù)均不顯著，所以交互作用的影響相對較小。

3.2.3 響應(yīng)面直觀分析

各個因子交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖5。

從圖5 可以直觀地看出料液比、溫度的交互作用不大，并發(fā)現(xiàn)時間軸向等高線變化密集，而料液比軸向等高線的變化相對稀疏，故料液比對響應(yīng)值峰值的影響較時間影響大。當溫度位于中心水平時，時間和料液比的交互作用不大。當料液比位于中心水平時，時間和溫度有交互作用但不顯著。

3.2.4 最佳提取條件的確定

由SAS 分析得到，響應(yīng)值（Y）最大時，與其相對應(yīng)的蕎麥蜂花粉的最佳提取條件為料液比為1 ∶21.2，溫度為73.2 ℃，時間為58.9 min。理論最佳蕎麥蜂花粉提取率為89.3%。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取條件進行驗證試驗，3 次平行試驗得到的實際提取率為88.7%與理論值相差0.6%＜1%，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性。

圖5 各個因子交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 The response surface and contour map of interaction between every two factors

4 結(jié)論

從安全性和實用性考慮乙醇浸提法安全性高且易于實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。通過單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化，研究得到對蕎麥蜂花粉中黃酮類物質(zhì)提取的最佳條件為：乙醇濃度80%、料液比1 ∶21.2、提取溫度73.2 ℃、提取時間58.9 min，提取率最高，可達達88.7%。蕎麥蜂花粉可作為開發(fā)黃酮類物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)原料。

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