牡蠣多糖制備工藝優(yōu)化及體外抑菌活性的探討

田振華，李永斌，李穎，楚華航，郝麗麗，宿婷婷，張莉

（山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海 264209）

多糖為一類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物、微生物、動(dòng)物等有機(jī)物中。多糖在臨床上、食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)以及石油工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[1]。同時(shí)隨著海洋動(dòng)物資源的進(jìn)一步開發(fā)，海洋動(dòng)物多糖由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和多種生物活性越來越受到人們的關(guān)注[2]。但是動(dòng)物多糖抑菌效果的研究較少，目前鮮有報(bào)導(dǎo)出現(xiàn)。

牡蠣俗稱海蠣子，是世界第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國四大養(yǎng)殖貝類。牡蠣中含有海洋生物特有的多種活性物質(zhì)，其中含有的多糖，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖、血脂、等生物活性[3]。但是關(guān)于牡蠣多糖抑菌性的研究卻沒有進(jìn)行過。

實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性，旨在為動(dòng)物多糖抑菌性研究提供思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

太平洋牡蠣：市售。

1.2 主要試劑

濃硫酸、重蒸苯酚、葡萄糖、無水乙醇、三氯乙酸、正丁醇、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

752 型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；PL303 電子分析天平：上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋：龍口市先科儀器公司；FJ—200高速分散均質(zhì)機(jī)：上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司；SC—3610 低速離心機(jī)：北京華辰樂天生物實(shí)驗(yàn)有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 牡蠣多糖提取

新鮮牡蠣去殼，去一定量牡蠣，清洗勻漿，取牡蠣勻漿液加入到一定pH 水溶液中水浴提取，過濾離心，減壓濃縮，以4 倍體積無水乙醇醇沉24 h，離心（3 500 r/min，20 min），95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌離心物兩次，烘干，得到牡蠣多糖干品。

1.4.2 酶法+sevag 法聯(lián)合除蛋白[4]

在水提取液中首先加入0.2%菠蘿蛋白酶于pH 為5.5，50 ℃下酶解3 h；然后調(diào)節(jié)pH 至8.5 加入堿性蛋白酶，在55℃下酶解4 h。將提取液置于90 ℃水浴10 min，滅活菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶。旋蒸液中加入sevag 液（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比），搖床震蕩15min，離心棄去沉淀，多次用sevag 法除蛋白直到不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀。利用考馬斯亮藍(lán)G-250 方法測定蛋白含量[5]。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線的繪制[6]

1.4.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)0.1 g 溶解稀釋至1 L 容量瓶，配成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.3.2 硫酸苯酚法測定含量

在具塞玻璃管中，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，加入1 mL 6%的重蒸苯酚溶液，再加入5 mL 濃硫酸，并用蒸餾水定容至8 mL，搖勻，沸水浴15 min，冷卻，于490 nm 處測定吸光度。

1.4.4 牡蠣多糖抑菌活性研究[7]

抑菌效果的檢測采用紙片瓊脂法，采用平板菌落計(jì)數(shù)法將受試菌在斜面培養(yǎng)基上活化2～3 代后，用接種環(huán)從斜面上輕刮菌苔一環(huán)，分別收集到內(nèi)盛10 mL生理鹽水的滅菌試管中，配成菌懸液備用。用打孔器將吸水力較強(qiáng)且質(zhì)地均勻的雙層濾紙打成直徑為6 mm 的圓形，置于潔凈干燥的試管內(nèi)，121 ℃干燥滅菌20 min。將濾紙片置于等量的各不同濃度的多糖稀釋液中浸泡1 h，吸取菌液0.2 mL，將其均勻地涂布于平板表面，每個(gè)培養(yǎng)皿均分為四部分，將濾紙片放置在相應(yīng)部分。并用蒸餾水浸泡作為空白對(duì)照。在37 ℃下，培養(yǎng)24 h，觀察多糖溶液的抑菌情況，并測量抑菌環(huán)直徑。每種菌重復(fù)試驗(yàn)3 個(gè)平板，計(jì)算其平均值。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由紫外可見得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線表1。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=6.782 1x-0.008 8，線性良好R2=0.997 9。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 The table of making standard curve

根據(jù)表1 得到多糖含量為77.14%，經(jīng)過除蛋白后蛋白含量下降至1.21%，可以認(rèn)定蛋白對(duì)試驗(yàn)影響較小。

2.2 牡蠣多糖提取正交試驗(yàn)提取

牡蠣多糖正交試驗(yàn)提?。焊鶕?jù)各試驗(yàn)因素的水平試驗(yàn)結(jié)果，選定以pH、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比作為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)五因素、四水平的正交試驗(yàn)，對(duì)牡蠣多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，提取的正交試驗(yàn)因素與水平如表2 所示，提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 提取的正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors level table of orthogonal experiment

表3 提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3 分析多糖提取最佳條件為：A4、B2、C2、D3、E3，即：pH 為8.0、溫度為65 ℃、時(shí)間為4 h、次數(shù)為3次、料液比為1 ∶15 mg/mL，各因素對(duì)多糖提取率的影響順序?yàn)椋簆H＞時(shí)間＞料液比＞次數(shù)＞溫度。用該工藝提取銀條多糖的工藝簡單、提取率高、操作控制容易、穩(wěn)定性好。

2.3 抑菌效果

0.02 mg/mL 金黃色葡萄球菌抑菌效果對(duì)比見圖1、圖2，同濃度的多糖對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果對(duì)比見圖3、圖4，由于多糖對(duì)大腸桿菌抑菌效果較弱，因此較高濃度0.08 mg/mL 多糖對(duì)大腸桿菌抑菌效果對(duì)比見圖5、圖6。

圖1 0.02 mg/mL 多糖對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圖Fig.1 0.02 mg/mL polysaccharide on Staphylococcus aureus bacteriostatic diagram

圖2 對(duì)照組金黃色葡萄球菌Fig.2 Control group of Staphylococcus aureus

圖3 0.2 mg/mL 多糖對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌圖Fig.3 0.2 mg/mL polysaccharide on Bacillus subtilis bacteriostatic diagram

圖4 對(duì)照組枯草芽孢桿菌Fig.4 Control group of Bacillus subtilis

圖5 0.8 mg/mL 多糖對(duì)大腸桿菌抑菌圖Fig.5 0.8 mg/mL polysaccharide on Escherichia coli bacteriostatic diagram

圖6 對(duì)照組大腸桿菌Fig.6 Control group of Escherichia coli

2.4 抑菌圈直徑

不同濃度牡蠣多糖溶液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑見表4。

表4 不同濃度的牡蠣多糖溶液對(duì)細(xì)菌的抑菌圈直徑Table 4 The effect of oyster polysaccharide on the diameter of inhibition zone

由表4 可知，牡蠣多糖對(duì)以上3 種菌類都有一定的抑制效果，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳，枯草芽孢桿菌效果次之，對(duì)大腸桿菌抑制效果最弱。

3 分析討論

1）多糖提取過程中優(yōu)化了提取的溫度、pH、提取時(shí)間、次數(shù)、料液比等問題，根據(jù)各因素的影響情況，得到多糖提取最佳條件，但是實(shí)際操作中，從能源角度出發(fā)，多糖提取可以適當(dāng)增加單次提取時(shí)間，以減少提取次數(shù)、溫度因素。

2）多糖抑菌的機(jī)理尚不明確，但是普遍認(rèn)為主要是抑制細(xì)菌或者真菌細(xì)胞新陳代謝重要環(huán)節(jié)或者酶系統(tǒng)[8]，根據(jù)抑制代謝環(huán)節(jié)的不同其抑菌效果也有不同。實(shí)驗(yàn)中抑制金黃色葡萄球菌效果強(qiáng)于枯草芽孢桿菌強(qiáng)于大腸桿菌。因此可能的原因是：牡蠣多糖能夠?qū)?xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生影響，改變細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性，破壞細(xì)胞細(xì)胞膜的超分子結(jié)構(gòu)而造成細(xì)胞內(nèi)成分流失，起到抑菌效果；也有可能是多糖作用于細(xì)菌細(xì)胞壁影響細(xì)菌新陳代謝。

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