凝集素組織化學(xué)技術(shù)在針刺干預(yù)腦梗塞后微血管形態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用＊

石 磊 杜元灝 黎 波 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（天津300193）

親合組織化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高度親合力而建立的一種方法，它不同于免疫組織化學(xué)，不屬于抗原抗體反應(yīng)，又與組織化學(xué)有本質(zhì)上的區(qū)別，因此，Bayer（1976）首次稱之為親合組織化學(xué)。凝集素不是來源于或參與免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，但它具有與特定糖基相結(jié)合的特性，因而，凝聚素可以作為一種探針來研究細(xì)胞上的糖基，特別是細(xì)胞膜的微小化合物結(jié)構(gòu)，從而探索細(xì)胞的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和演變過程。這種技術(shù)一方面利用凝集素與酶、熒光素、膠體金等標(biāo)記物結(jié)合，另一方面又可以與細(xì)胞膜糖基結(jié)合形成一種親合反應(yīng)，因此，Ponder（1983）提出應(yīng)稱為“凝集素組織化學(xué)”而不能稱為“凝集素免疫組織化學(xué)”。凝集素染色可采用直接法或間接法［1，2］，目前應(yīng)用較多的則是糖－凝集素－糖法。

本研究將這一技術(shù)應(yīng)用于針刺干預(yù)腦梗塞后微血管形態(tài)學(xué)變化的實(shí)驗(yàn)中，并進(jìn)一步根據(jù)研究要求進(jìn)行方法調(diào)整，現(xiàn)將研究方法及部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果介紹如下。

1 方法 筆者根據(jù)Gavin Thurston等的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行調(diào)整［3，4，5］，在腦梗塞急性期血管形態(tài)學(xué)變化及針刺干預(yù)效應(yīng)研究中，以凝集素組織化學(xué)技術(shù)對急性期MCAO 大鼠腦血管形態(tài)變化進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)步驟簡介如下：①采用Longa的腔內(nèi)線栓法阻滯大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈，復(fù)制腦梗塞模型：選擇健康雄性Wistar大鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供），體重180～200g，隨機(jī)分為模型對照組和電針干預(yù)組，普通層流架系統(tǒng)喂養(yǎng)。②處理方法：電針干預(yù)組在MCAO 后即刻針刺人中穴，用15Hz，1mA 的電刺激持續(xù)20min；模型對照組和空白對照組均同樣抓取固定，但不進(jìn)行任何治療。③樣本制備：針刺治療組、模型對照組分別在MCAO 后1、3、6h，于一側(cè)股靜脈注射生物素化番茄凝集素（Vector公司，貨號：B－1175，100μg／100μL生理鹽水），2min后，開胸行心臟灌注，灌注液為1%多聚甲醛與0.5%戊二醛混合PBS緩沖液，130mmHg壓力連續(xù)灌注5min，取腦，冰凍切片，切片厚度35μm。冷丙酮固定10min，－20℃保存待檢。④染色：取冰凍切片，PBS緩沖液洗5min×2，置于PBS緩沖液（含0.3%Triton X－100）中，37℃孵育4h，滴加ABC復(fù)合物（Vector公司，貨號：PK－4000），37℃孵育1h后，PBS緩沖液洗5min×2，滴加DAB（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI－9032）染色試劑反應(yīng)15min，徹底水洗終止反應(yīng)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 研究結(jié)果

2.1 染色結(jié)果 染色結(jié)果如圖1所示。染色結(jié)果顯示，凝集素組織化學(xué)技術(shù)可以比較完整、立體的顯示腦組織微血管形態(tài)以及腦實(shí)質(zhì)血管分布特征，血管經(jīng)染色后邊緣清楚，與組織背景色彩對比明顯，便于計(jì)量統(tǒng)計(jì)和圖像的分析、處理。

2.2 結(jié) 果 采用Pro－Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集并導(dǎo)出相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表1。

表1 MCAO 大鼠梗死塞周圍腦血管量比較（±sR，n＝6）

表1 MCAO 大鼠梗死塞周圍腦血管量比較（±sR，n＝6）

△表示與空白對照組比較P＜0.001，▲表示與模型對照組比較P＜0.01。

時(shí)間空白對照組模型對照組電針干預(yù)組317.00±7.40梗塞1h136.20±2.96△ 195.50±5.61△▲梗塞3h130.39±9.58△192.50±10.98△▲梗塞6h130.83±7.97△ 186.28±9.82△▲

梗死塞周圍腦血管量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型對照組在MCAO 后1、3、6h血管量均顯著減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.001），電針干預(yù)組與相對應(yīng)模型對照組各時(shí)相比較，血管量均顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），但是仍顯著少于空白對照組（P＜0.001）。

表2 MCAO 大鼠梗塞區(qū)腦血管量比較（±sR，n＝6）

表2 MCAO 大鼠梗塞區(qū)腦血管量比較（±sR，n＝6）

△表示與空白對照組比較P＜0.05，◇表示與模型對照組比較P＜0.05

時(shí)間空白對照組模型對照組電針干預(yù)組152.40±2.50梗塞1h115.80±3.67△ 132.50±5.52△◇梗塞3h116.24±4.28△ 132.40±4.28△◇梗塞6h116.33±3.11△ 129.93±5.98△◇

梗死塞腦血管量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型對照組在MCAO 后1、3、6h血管量均顯著減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），電針干預(yù)組與模型對照組比較，各時(shí)相腦血管數(shù)均增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但是，與空白對照組比較仍顯著減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖1 番茄凝集素對大鼠腦微血管形態(tài)研究 DAB染色

3 討 論 凝集素組織化學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等相關(guān)領(lǐng)域，關(guān)于凝集素及其應(yīng)用的研究在國外的文獻(xiàn)報(bào)道中多見［6，7，8，9］，但在國內(nèi)鮮有報(bào)道，本研究將這一方法應(yīng)用于腦梗塞急性期血管形態(tài)學(xué)變化及針刺干預(yù)效應(yīng)研究中，從研究結(jié)果可見：凝集素組織化學(xué)染色可清晰、完整的顯示腦微血管形態(tài)，圖像對比度明顯，便于圖像分析、數(shù)據(jù)提取并更好地保證了分析結(jié)果的可靠性。

本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：電針干預(yù)可增加MCAO 模型大鼠梗死區(qū)及周圍有血流灌注的腦血管量，提示電針干預(yù)能夠更好的促進(jìn)腦梗塞急性期側(cè)支循環(huán)建立，從而增加腦血流灌注。

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