枸杞多糖對(duì)小鼠移植性肝癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉 靜 陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系（西安710100）

肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，目前針對(duì)其治療多采用放療或化療法，但這種傳統(tǒng)方法無法抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也帶來不同程度的損害，多具有一定的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，預(yù)后較差［1，2］。枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBP）是由枸杞子經(jīng)脫脂，水提等步驟獲得的蛋白多糖。近年來藥理研究表明，枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗突變、抗病毒、抗感染等多種生物活性［3］。其對(duì)于癌細(xì)胞不具有直接殺傷作用，而是通過中間宿主效應(yīng)，在多個(gè)層面，多條途徑上作用于免疫細(xì)胞，加強(qiáng)機(jī)體免疫功能，增加抗體的分泌，達(dá)到抑制或殺傷癌細(xì)胞的作用。本研究中將枸杞多糖作用于移植性肝癌的小鼠，探討枸杞多糖對(duì)肝癌的抑制作用。

1 資料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株 昆明種小鼠48只，清潔級(jí)，5～7周齡，體質(zhì)量（18.5±2.4）g，雌雄各半，由吉林省藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。原發(fā)性肝癌H22腹水型細(xì)胞株購自中科院藥物研究所。

1.2 藥物與試劑枸杞多糖購自上?？抵壅婢嗵怯邢薰荆?hào)20110211。環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)110412132。

1.3 儀器 Olympus光學(xué)顯微鏡（日本）；LDZ－5低溫高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；Airtech 無菌超凈工作臺(tái)（蘇州富泰潔凈系統(tǒng)有限公司）；96孔培養(yǎng)板（美國COSFT）；TP－100天平（北京賽得利斯）。

1.4 模型制備 將健康小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只：肝癌細(xì)胞接種方法為取醫(yī)用酒精消毒小鼠腋下皮膚，抽取已感染H22瘤株的小鼠新鮮腹水，于小鼠右側(cè)腋窩下接種0.1mL（約含H22瘤細(xì)胞4×106個(gè)），制備荷瘤小鼠模型。A 組為對(duì)照組，未接種肝癌細(xì)胞，接種同劑量生理鹽水。接種后，腹腔注射生理鹽水；B 組為模型組，接種肝癌細(xì)胞后，腹腔注射生理鹽水；C組為環(huán)磷酰胺組，在接種肝癌細(xì)胞后注射20mg／kg的環(huán)磷酰胺；D 組、E組、F組作為枸杞多糖高、中、低劑量組，接種肝癌細(xì)胞后，分別腹腔注射20mg／kg、10mg／kg、5mg／kg的枸杞多糖。

每組分別給藥4周，給藥結(jié)束后以眼球摘除法取血，分離血清，在酶標(biāo)儀上測(cè)定（波長(zhǎng)為492nm）血清中TNF－α含量，復(fù)孔檢查，根據(jù)樣品OD 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的TNF－α含量。

頸椎脫臼處死小鼠，取腫瘤組織，稱質(zhì)量，并將腫瘤組織置于甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，觀察病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以（±s）表示，多樣本均數(shù)間比較采用One－way ANOVA 分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 枸杞多糖對(duì)荷瘤小鼠TNF－α的影響由表1可知，枸杞多糖高、中、低劑量組（D、E、F組）TNF－α分泌較模型組（B組）相比，有顯著性升高（P ＜0.05），表明枸杞多糖對(duì)TNF－α分泌有促進(jìn)作用，可增強(qiáng)直接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞的作用。

表1 各組小鼠TNF－α濃度比較（±s）

表1 各組小鼠TNF－α濃度比較（±s）

注：與B組比較，△P ＜0.05

組別例數(shù)TNF－α（ug／mL）A 組8 68.61±2.68△B組8 54.38±5.49 C組8 66.69±4.52△D 組8 71.77±5.43△E組8 76.48±3.46△F組8 79.19±3.45△

2.2 各組小鼠腫瘤體積與質(zhì)量的比較 枸杞多糖高、中、低劑量組（D、E、F 組）與模型組（B 組）相比，腫瘤體積明顯縮小，腫瘤質(zhì)量降低（P ＜0.05）。同時(shí)環(huán)磷酰胺組腫瘤體積亦有明顯減小，抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用與枸杞多糖高劑量組相比，基本接近，差異無顯著性意義。

表2 各組小鼠TNF－α濃度比較（±s）

表2 各組小鼠TNF－α濃度比較（±s）

注：與B組同項(xiàng)指標(biāo)相比，△P ＜0.05

組別例數(shù)腫瘤體積（mm3）腫瘤質(zhì)量（g）A 組8 0 0 B組8 984.32±47.28 4.68±0.38 C組8 619.47±38.59△2.53±0.54△D 組8 671.79±53.59△2.57±0.59△E組8 726.63±36.42△3.28±0.37△F組8 875.17±38.37△3.94±0.51△

2.3 腫瘤的組織學(xué)改變 Olympus 光學(xué)顯微鏡可見，枸杞多糖高劑量組與環(huán)磷酰胺組腫瘤壞死程度最為明顯，壞死范圍最廣；淋巴細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞浸潤更為明顯，且纖維組織增生也較為明顯。枸杞多糖中、低劑量組較模型組相比，腫瘤組織與正常組織交界處亦可見不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤，但纖維組織增生不明顯。表明枸杞多糖高劑量與環(huán)磷酰胺可抑制癌瘤細(xì)胞，生成大量淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

3 討 論 原發(fā)性肝癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其病死率較高，預(yù)后較差。手術(shù)切除病灶無法保證切除所有癌變細(xì)胞，同時(shí)無法控制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［4］。而手術(shù)后的放療與化療的使用在殺傷癌變細(xì)胞的同時(shí)在一定程度上也損害了正常組織細(xì)胞，導(dǎo)致骨髓造血功能或免疫功能障礙，帶來較多的不良反應(yīng)。因此開辟新的治療途徑，尋求高效，低毒副作用的治療方法是目前研究中極為重視的問題。中藥治療腫瘤近年來得到了較大的關(guān)注并取得了不錯(cuò)的進(jìn)展。由于中藥毒副作用較低，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，因此開發(fā)中草藥在腫瘤治療中意義重大［5］。

枸杞多糖是枸杞的重要活性成分，經(jīng)研究表明，枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、降血脂、降血糖、清除氧自由基、延緩衰老、抗疲勞等功能。大量的試驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞多糖諸多功能的發(fā)揮源于其對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。其對(duì)癌細(xì)胞并不具有直接抑制或殺傷作用，而是通過中間宿主效應(yīng)，即增強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌瘤的免疫功能等途徑發(fā)揮抑制作用而實(shí)現(xiàn)的［6］。枸杞多糖可通過多條途徑、多個(gè)層面對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，一方面能激活T、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)抗體的分泌。另一方面通過誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞分泌γ－干擾素，增加巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并促進(jìn)白細(xì)胞介素與腫瘤壞死因子的分泌，加強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能，從而對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［7］。

在本研究中，枸杞多糖對(duì)荷瘤小鼠中肝癌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。枸杞多糖不同劑量組腫瘤重量均低于腫瘤模型組，同時(shí)腫瘤體積亦明顯低于模型組。癌變部位組織學(xué)比較中，枸杞多糖高劑量組與環(huán)磷酰胺組的腫瘤壞死程度重且范圍廣，淋巴細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞浸潤更為明顯，且纖維組織增生也較為明顯。環(huán)磷酰胺作為一種廣譜的抗癌藥，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損傷快速增殖的正常細(xì)胞，因此其雖具有明顯的抑瘤作用，但不良反應(yīng)嚴(yán)重。枸杞多糖高劑量組與環(huán)磷酰胺對(duì)于腫瘤壞死程度的影響療效相當(dāng)，但其毒副作用小，因此更適于臨床應(yīng)用，是較為理想的抗腫瘤輔助治療藥物［8］。枸杞多糖對(duì)肝癌抑制作用的機(jī)制尚不明確，結(jié)合小鼠實(shí)驗(yàn)研究提示可能與下列機(jī)制有關(guān)［9，10］：①枸杞多糖可對(duì)體液免疫起到調(diào)節(jié)作用，可提高小鼠淋巴細(xì)胞增殖，增加小鼠總T 細(xì)胞與T 細(xì)胞亞群，是降低的免疫細(xì)胞恢復(fù)至正常水平，相助增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率與CTL的殺傷能力；②增強(qiáng)小鼠對(duì)單核巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)，通過處理抗原與釋放可溶性因子對(duì)抗腫瘤方面起到重要作用。枸杞多糖可增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF，提高胞內(nèi)溶菌酶與超氧化物歧化酶的活性，進(jìn)而溶解腫瘤細(xì)胞；③枸杞多糖可增加NK 細(xì)胞殺傷活性，增加白細(xì)胞數(shù)量，拮抗NK 細(xì)胞的活性降低，提高IL－2因子的場(chǎng)所，維持NK細(xì)胞活性；④誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的受體與腫瘤細(xì)胞表面IgG 結(jié)合，發(fā)生特異性免疫而殺傷腫瘤細(xì)胞。

綜上所述，枸杞多糖對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，能有效增強(qiáng)宿主的免疫能力，提高機(jī)體免疫殺傷能力。因此，枸杞多糖在抗肝癌藥物研發(fā)與臨床應(yīng)用上具有廣闊的前景。

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