商陸皂苷甲對腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響＊

張祥貴 湯杰印 遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬（珠海）醫(yī)院腎內(nèi)科（珠海519100）

商陸皂苷甲（esculentoside A，EsA）是從中草藥商陸塊根中提純的一種三萜皂苷類化合物，已被證實(shí)有顯著調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抑制細(xì)胞增殖和促凋亡的作用［1，2，3，4，5］，在自身免疫性腎炎動物模型中顯示良好的治療效果［6，7］，本課題通過EsA 對BXSB小鼠的治療觀察發(fā)現(xiàn)，EsA 可顯著抑制狼瘡模型小鼠血清IL－6，TNF－a的表達(dá)，明顯改善蛋白尿及腎臟的炎癥［8］，EsA還抑制了腎臟組織Bcl－2，PCNA 的表達(dá)，并誘導(dǎo)Fas，F(xiàn)asL，Caspase－3的表達(dá)，使腎小球內(nèi)有核細(xì)胞數(shù)及系膜區(qū)面積測定明顯減少，抑制了腎組織的增殖，促進(jìn)了腎固有細(xì)胞的凋亡，明顯改善了腎臟的病理狀況［9，10］。本實(shí)驗(yàn)選用大鼠腎小球系膜細(xì)胞（rat glomerular mesangial cell，rGMC）為對象，觀察EsA對體外培養(yǎng)的rGMC 增殖和毒性的影響，旨在為明確EsA 治療狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）等系膜增殖性腎炎腎組織的作用靶點(diǎn)，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法 1.1 材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株（HBZY－1）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）；商陸皂苷甲購自上海同田公司，批號：10072431，白色粉劑（不溶于水），于實(shí)驗(yàn)前溶于0.1%DMSO 溶液中，MTT、DMSO、胰酶（含0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 和酚紅）購自Sigma公司，MEM培養(yǎng)液購自Genom 公司，優(yōu)級胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青公司，酶標(biāo)儀（ELX800）為Bio－Tek Instruments INK（美國）公司。

1.2 方 法 1.2.1 rGMC 培養(yǎng)：rGM 購回后于倒置顯微鏡下見細(xì)胞呈梭形生長，鋪滿瓶底，培養(yǎng)液透明清亮，適應(yīng)性培養(yǎng)4h后吸取全部培養(yǎng)液（5%FBS的MEM 培養(yǎng)液）入無菌瓶內(nèi)，并將FBS濃度由5%調(diào)整為10%做GMC 培養(yǎng)備用。用PBS液洗細(xì)胞2次，加入胰酶消化細(xì)胞，見細(xì)胞變圓，呈片狀脫落時(shí)，加入10%FCS的MEM 培養(yǎng)液，終止消化，將細(xì)胞懸液移入離心管中，800 轉(zhuǎn)，4min 離心后，棄去上清液，加入3mL10%FCS的MEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1：3接種于25mm2培養(yǎng)瓶，每瓶加入10%FBS的MEM 培養(yǎng)液至5mL，吹打均勻，放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換1 次液，細(xì)胞生長迅速，3d傳1次代。本實(shí)驗(yàn)均采用6～9代rGMC。

1.2.2 MTT 法測定DMSO 對rGMC 增殖影響：由于EsA 不溶于水，DMSO 是“萬能溶劑”，且通常將10%DMSO 用于細(xì)胞凍存，但不同濃度的DMSO 對不同細(xì)胞的增殖有不同的影響，本實(shí)驗(yàn)欲用DMSO 溶解EsA，故需先選擇合適濃度的DMSO，使其對rGMC增殖無影響又能充分溶解EsA。

取對數(shù)生長期rGMC，用胰酶消化，離心收集細(xì)胞棄上清，用10%FBS的MEM 培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)制1×104／mL，每孔200ul接種于96孔板，37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，換用無血清的MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)rGMC24h，使細(xì)胞同步化生長于G0期。對照組加入10%FBS的MEM 培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組除加入上述培養(yǎng)液外，還分別加入終濃度為1.2%、1.0%、0.8%、0.5%、0.1%的DMSO，上述各組分別培養(yǎng)至24h，48h及72h，換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入0.5%MTT 20uL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上清，每孔加入150uLDMSO，振蕩l0min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm 波長處測定各孔吸光值（OD 值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.3 MTT 法測定EsA 對rGMC 增殖的影響：按上述培養(yǎng)方法，rGMC同步化生長于G0期后，對照組加入10%FBS的MEM 培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組除加入上述培養(yǎng)液外，還分別加入終濃度為20mg／L、10mg／L、5mg／L、2.5mg／L、1.25mg／L、0.625mg／L用DMSO 溶解的EsA，上述各組分別培養(yǎng)至24h，48h及72h時(shí)，換新鮮培養(yǎng)液，按上述方法加入MTT 培養(yǎng)4h后，加入DMSO 振蕩l0min 溶解結(jié)晶物，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm 波長處測定各孔OD 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.4 MTT 法測定EsA 對rGMC 毒性影響［11］：方法同上，只是在無血清同步后行藥物干預(yù)時(shí)，各組均改為無血清的MEM 培養(yǎng)液。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用s表示，多組間資料間均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異；多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較，方差齊者采用LSD－t檢驗(yàn)，方差不齊者用Tamhane＇sT2檢驗(yàn)，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。

2 結(jié) 果 2.1 rGMC 生長形態(tài)觀察 經(jīng)傳代后rGMC，24h后幾乎全部伸展貼壁，生長迅速，約2～3d鋪滿瓶底。在倒置顯微鏡下觀察，rGMC 呈梭形、不規(guī)則形、紡錘形、胞核居細(xì)胞中央呈卵圓狀，胞體多突起，生長密集時(shí)，細(xì)胞接觸間隙可消失（見圖1）。

圖1 a：正常培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)（×40倍） 圖1b：正常培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)（×200倍）Fig.1a：The form of normal cultured GMC（40×） Fig.1b：The form of normal cultured GMC（200×）

2.2 DMSO 對rGMC 增殖的影響 與對照組比較，0.1%DMSO 對rGMC在24h、48h、72h的細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組對rGMC的細(xì)胞增殖在24h、48h、72h的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)或者某1～2個(gè)時(shí)間點(diǎn)有明顯的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），故宜用0.1%DMSO 溶解EsA。見表1。

表1DMSO 對rGMC毒性作用的OD 值（±s）

表1DMSO 對rGMC毒性作用的OD 值（±s）

注：△與對照組比較，P＜0.05，▲與對照組比較，P＜0.01.

Group n OD（24h）OD（48h）OD（72h）Control 6 0.541±0.022 0.821±0.069 1.657±0.260 DMSO（1.2%）6 0.437±0.054 1.257±0.088▲0.913±0.067▲DMSO（1.0%）6 0.637±0.063 1.145±0.203▲0.878±0.189▲DMSO（0.8%）6 0.589±0.164 1.020±0.191△1.119±0.092▲DMSO（0.5%）6 0.530±0.104 1.231±0.101▲1.468±0.106 DMSO（0.1%）6 0.530±0.065 0.927±0.080 1.738±0.177

2.3 EsA 對rGMC 的毒性影響 與對照組比較，濃度在0.625～20mg／L間，EsA 對rGMC 活力無明顯抑制作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2

表2 EsA 對rGMC毒性作用的OD 值（±s）

表2 EsA 對rGMC毒性作用的OD 值（±s）

Group n OD（24h）OD（48h）OD（72h）Control 6 0.281±0.057 0.226±0.091 0.208±0.018 EsA（20mg／L）6 0.256±0.015 0.233±0.486 0.200±0.103 EsA（10mg／L）6 0.263±0.105 0.194±0.343 0.197±0.025 EsA（5mg／L）6 0.225±0.040 0.234±0.044 0.181±0.056 EsA（2.5mg／L）6 0.240±0.059 0.212±0.028 0.210±0.051 EsA（1.25mg／L）6 0.292±0.128 0.198±0.456 0.165±0.035 EsA（0.625mg／L）6 0.216±0.039 0.192±0.191 0.184±0.028

2.4 EsA 對rGMC的增殖影響 與對照組比較，EsA（2. 5－5mg／L）在48h，72h，明顯抑制了細(xì)胞的增殖（P＜0.05 或P＜0.01），見表3。

表3EsA 對rGMC增殖作用的OD 值（±s）

表3EsA 對rGMC增殖作用的OD 值（±s）

注：△與對照組比較，P＜0.01，▲與對照組比較P＜0.05

Group n OD（24h）OD（48h）OD（72h）對照組6 0.529±0.081 0.808±0.021 1.331±0.219 EsA（20mg／L）6 0.547±0.362 0.863±0.903 1.218±0.165 EsA（10mg／L）6 0.547±0.097 0.880±0.080 1.330±0.146 EsA（5mg／L）6 0.508±0.018 0.642±0.060△0.966±0.325△EsA（2.5mg／L）6 0.478±0.043 0.716±0.081▲1.032±0.123▲EsA（1.25mg／L）6 0.479±0.026 0.815±0.056 1.271±0.185 EsA（0.625mg／L）6 0.473±0.053 0.805±0.041 1.232±0.218

討 論 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematiosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)自身免疫性疾病。SLE 常累及腎臟引起LN，其病理表現(xiàn)主要是GMC 大量增殖［12］。GMC 是腎小球固有細(xì)胞之一，正常情況下，幾乎不增殖，炎癥狀態(tài)下，被活化后，可見異常增殖，引起細(xì)胞外基質(zhì)增加，降解減少，并釋放各種生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)可趨化單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，使其釋放炎癥介質(zhì)，又進(jìn)一步活化了GMC，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致腎小球硬化，及終末期腎臟病（end－stage renal disease，ESRD）。由于GMC 增殖是多種腎小球疾病的共同病理表現(xiàn)，抑制GMC增殖對延緩腎小球疾病發(fā)生，發(fā)展有重要的臨床意義，并已成為研究的熱點(diǎn)。由于GMC 是各種致病因子作用的主要靶細(xì)胞，體外培養(yǎng)GMC 已成為研究腎臟病理生理的主要方法之一。

EsA 既往研究顯示其具有顯著的抑制血清中炎性細(xì)胞因子（如IL－1、TNFα、IL－6、PAF及活性氮等）的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用，具有抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，而改善了銀屑病病情等作用［5］，用EsA 治療大鼠Heymann腎炎可以顯著減少尿蛋白的產(chǎn)生，免疫熒光和電鏡檢查發(fā)現(xiàn)EsA 能明顯改善大鼠腎炎的病理狀況，并有學(xué)者在臨床上用原藥商陸治療難治性LN 和原發(fā)性腎病綜合征也收到良好的效果，同時(shí)我們實(shí)驗(yàn)組通過體內(nèi)使用EsA 治療BXSB 小鼠后，也收到了明顯的療效，狼瘡腎炎模型小鼠腎組織和血清中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和腎組織增殖明顯受到抑制，顯示了EsA 具有抗炎、抑制細(xì)胞增殖和促凋亡的作用。MTT 實(shí)驗(yàn)是檢測細(xì)胞增殖的可靠且最常用的方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EsA（2.5～5mg／L）對血清誘導(dǎo)的rGMC增殖48～72h有顯著的抑制作用，表明了GMC 是EsA治療系膜增殖性腎炎的重要靶細(xì)胞，提示EsA 可通過抑制細(xì)胞增殖的方式干預(yù)系膜增殖性腎炎的病理進(jìn)程，從而延緩腎小球硬化和腎臟纖維化，在腎臟疾病的治療中可能具有一定的應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)研究濃度范圍內(nèi)EsA 對rGMC活力沒有明顯影響，抑制細(xì)胞增殖不是通過細(xì)胞毒作用促使細(xì)胞壞死實(shí)現(xiàn)的。

［1］ Xiao Z Y，Zheng Q Y，Zhang J P，et al.Effect of esculentoside A on Autoinmmunity in mice and its possible mechanisms［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23（7）：638－644.

［2］ Xiao Z Y，Zheng Q Y.Effect of esculentoside A on production of interleukin－1、2and prostaglandin E2［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25（6）：817－821.

［3］ Zhenlin Hu，Lei Qiu，Zhenyu Xiao，et al.Effects of esculentoside A on autoimmune Syndrome induced by Campylobacter jejuni in mice and its modulation on T－lymphocyte proliferation and apoptosis［J］.International Immunopharmacology，2010，10（1）：65－71.

［4］ 肖振宇，鄭欽岳，張俊.商陸皂苷甲對小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23（6）：659－661.

［5］ 鄧 俐，張德堂，杜 江.商陸皂苷甲對體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2006，20（11）：655－657.

［6］ 張 亮，張克非，吳雄飛.商陸皂苷甲對大鼠抗Thy1系膜增殖性腎炎的治療作用［J］.中國中西醫(yī)腎病結(jié)合雜志，2008，9（6）：506－508.

［7］ 肖振宇，鄭欽岳，張俊平，等.商陸皂苷甲對自身免疫綜合征模型小鼠的療效［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（10）：1108－1111.

［8］ 馬華林，張欣洲，張祥貴.商陸皂苷甲治療BXSB狼瘡性腎炎小鼠的實(shí)驗(yàn)研究［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2011，32（12）：1540－1542.

［9］ 楊 丹.商陸皂苷甲對BXSB 小鼠腎臟細(xì)胞凋亡及Bax和Bcl－2表達(dá)的影響［D］.遵義：遵義醫(yī)學(xué)院，2010：1.

［10］ 孟令國.商陸皂苷甲對BXSB 小鼠腎組織PCNA、Caspase－3、Fas和FasL 表達(dá)的影響［D］.遵義：遵義醫(yī)學(xué)院，2011：1.

［11］ 祝正明，孫建實(shí)，趙 湘.三七總皂苷對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2007，8（8）：471－472.

［12］ 陳灝珠，林果為，主編.實(shí)用內(nèi)科學(xué)［M］.第13版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：2286－2293.