紅芪膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究＊

徐勝龍 王 晉 李 靜 郭國(guó)禎 李予蓉 第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室（西安710032）

紅芪膠囊是第四軍醫(yī)大學(xué)放射醫(yī)學(xué)教研室新研制的純中藥制劑，由紅景天、黃芪、沙棘、刺五加浸膏4味中藥組方而成。屬于創(chuàng)新中藥6.1類，其功能生津養(yǎng)血，補(bǔ)腎健脾；主治各類放射損傷，增強(qiáng)放射治療療效和減輕放療毒副反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)系首次將以上四味藥配伍制備膠囊劑用于主治放射損傷等的新藥研究，并獲得國(guó)家專利（ZL200910021359.6）。

方中黃芪、刺五加浸膏為臣藥，沙棘為佐藥，共同輔佐紅景天的活血化淤消腫、解熱退燒、滋補(bǔ)元?dú)獾裙π?。藥效學(xué)研究結(jié)果表明［1］［2］，紅芪膠囊可提高機(jī)體氧化和還原反應(yīng)的比值，清除體內(nèi)過(guò)剩的自由基，具有降低脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的作用和抗氧化酶活性的能力，從而減輕對(duì)生物細(xì)胞膜組織的損傷。并能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基的傳遞，且有明顯的藥物劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)紅芪膠囊具有高效低毒、多靶點(diǎn)和作用持久等功能特點(diǎn)。為了對(duì)該膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制，穩(wěn)定性考查以及保證臨床用藥安全，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)紅芪膠囊中紅景天及黃芪的有效成分用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別；針對(duì)紅景天采用高效液相色譜法測(cè)定膠囊中紅景天苷的含量，進(jìn)行定量分析；依據(jù)藥典附錄要求，對(duì)膠囊的崩解時(shí)限、微生物限度、重金屬、砷鹽限量等進(jìn)行考察。以期為該膠囊劑可靠、準(zhǔn)確、靈敏度高的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試藥與儀器 1.1儀器 美國(guó)Waters高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），2695分離單元，2996檢測(cè)器，Empower色譜工作站，配自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱（UltimateTM C18柱，4.6×250mm，5μm，Welch Materials，Inc.）；R200D 電子分析天平（德國(guó)Satorius公司）；電子天平，MP 2002，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器，SK 250LHC，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 紅芪膠囊（第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院提供，批號(hào)：20091205，20091215，20091225。該膠囊已申請(qǐng)中國(guó)發(fā)明專利，專利號(hào)200910021359.6已公示）。紅景天苷（C14H20O7），批號(hào)110752—200511，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；甲醇（CH3OH），AR級(jí)，西安化學(xué)試劑廠；甲醇（CH3OH），HPLC 級(jí)，美國(guó)Heneywell公司；超純水（H2O），美國(guó)Millipore純水器制備）；硅膠G 板（青島海洋化工廠）：CS 9000型薄層掃描儀（日本島津）：自動(dòng)噴霧顯色器：定量點(diǎn)樣毛細(xì)管（Drummond，USA）。

2 方法與結(jié)果 2.1 紅芪膠囊的制備 將紅景天進(jìn)行除雜處理后，粉碎，采用70%乙醇回流提取，加醇量為8倍量，回流兩次，每次回流2h，合并濾液，濃縮，減壓干燥。黃芪和沙棘混合加8倍量水煎煮兩遍，每次1.5h，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，減壓干燥，所得干膏與刺五加浸膏及上述紅景天干膏，粉碎，加入適量的輔料，混合均勻，95%乙醇制粒，60℃以下烘干，過(guò)20目篩，裝入0號(hào)膠囊，即得。

2.2 紅芪膠囊的性狀［2］本品為膠囊劑，3批樣品觀察，除去膠囊殼后顯淺棕色至棕褐色；氣微香、味微苦。

2.3 理化顯色法鑒別紅芪膠囊［2］取本品內(nèi)容物2g，加乙醇20mL 使溶解，濾過(guò)。取濾液1mL，加3%碳酸鈉溶液1mL 與新配制的重氮對(duì)硝基苯胺試液1～2滴，即顯紅色；另取濾液1mL，加5%亞硝酸鈉溶液3～5滴與10%硝酸鋁溶液3～5滴，稍放置，加氫氧化鈉試液2mL，即顯紅棕色。

2.4 薄層色譜法定性鑒別 2.4.1紅景天的薄層色譜法鑒別：取本品內(nèi)容物約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品備用。精密稱取紅景天苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－丙酮－水（6∶3∶1∶1）的下層溶液為展開(kāi)劑［3］，展開(kāi)，展距18cm，取出，晾干，置碘蒸氣中熏2～3min。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 紅芪膠囊中紅景天的薄層色譜圖

2.4.2 黃芪的薄層色譜鑒別：取本品內(nèi)容物2g，加甲醇20mL，加熱回流1h，濾過(guò)，濾液加于中性氧化鋁柱（100～120目，5g，內(nèi)徑10～15mm）上，用40%甲醇100mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用水飽和的正丁醇提取2 次，每次20mL，合并正丁醇液；用水洗滌2 次，每次20mL；棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5mL 使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13：7：2）的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)，紫外光燈（365nm）下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 紅芪膠囊中黃芪甲苷紫外薄層色譜圖

2.5 紅景天苷的含量測(cè)定［2，4］2.5.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱（UltimateTMC18柱，4.6×250mm，5μm）：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：甲醇－水（15︰85）；檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下紅景天苷峰理論板數(shù)計(jì)算不低于2000。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取紅景天苷對(duì)照品25.00mg，置于5mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為對(duì)照品母液。

2.5.3 供試品溶液與空白溶液的制備：取本品內(nèi)容物約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取過(guò)濾液，即得；依法制備空白溶液。

2.5.4 線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照平母液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5mL，置于5mL量瓶中，加甲醇至刻度，進(jìn)樣。以紅景天苷的峰面積（y）對(duì)紅景天苷的濃度（x）做線性回歸，得方程為y＝3138368x ＋10054，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9987，說(shuō)明紅景天苷的峰面積在0.10～1.50mg／mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn)：取濃度為0.25mg／mL 的對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值。紅景天苷的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（Relative Standard Devia－tion，RSD）值為0.39%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取濃度為0.25mg／mL 的對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別于0h、2h、4h、6h、8h、12h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示各時(shí)段峰面積平均值分別為779466.2、1952541紅景天苷的峰面積的RSD值分別為0.24%、0.17%，結(jié)果表明紅景天苷峰值在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)：分別制備6份供試品，在上述色譜條件下測(cè)定，測(cè)定峰面積，紅景天苷的峰面積的RSD 值為0.58%。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已測(cè)定供試品溶液（批號(hào)091215，0.16%）5份，分別添加一定量的紅景天，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，在上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，平均回收率為98.47%，RSD 值為0.71%。結(jié)果表明紅景天苷回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 供試品中紅景天苷加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.5.9樣品測(cè)定：分別從3批紅芪膠囊中取樣，每個(gè)批次精密稱定膠囊內(nèi)容物約，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得上樣溶液。在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖3。

每粒膠囊含紅景天苷限度確定：三批樣品平均含量為0.16%。依據(jù)日處方量，經(jīng)小試、中試確定了千粒處方。據(jù)千粒處方得紅芪膠囊主藥紅景天中紅景天苷含量：400×0.16%× （1±10%）＝0.576～0.704（mg／粒），考慮到產(chǎn)品批量生產(chǎn)及穩(wěn)定性諸因素的變化，擬規(guī)定紅芪膠囊每粒含紅景天苷計(jì)，不得少于0.50mg／粒。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批紅芪膠囊樣品測(cè)定結(jié)果

2.6 崩解時(shí)限檢查 依據(jù)《中國(guó)藥典2010年版一部》附錄ⅠL 膠囊劑下有關(guān)規(guī)定，照崩解時(shí)限檢查法（附錄ⅫA）檢查。對(duì)本實(shí)驗(yàn)的3批紅芪膠囊樣品進(jìn)行了檢查，結(jié)果平均崩解時(shí)限為36.3min，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.7 微生物限度 依據(jù)《中國(guó)藥典2010年版一部》附錄ⅠL 膠囊劑下有關(guān)規(guī)定，照微生物限度檢查法（附錄ⅩⅢC）檢查。對(duì)本實(shí)驗(yàn)的3批紅芪膠囊樣品進(jìn)行了檢查，結(jié)果顯示細(xì)菌含量平均為52個(gè)／g，霉菌含量平均＜10個(gè)／g，未檢測(cè)出含有大腸桿菌。

圖3 紅芪膠囊中黃芪甲苷和紅景天苷的HPLC色譜圖

2.8 重金屬、砷鹽限量檢查 《中國(guó)藥典2010年版一部》附錄ⅠL 膠囊劑下雖未有關(guān)于重金屬、砷鹽限量檢查項(xiàng)，鑒于中藥新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，按《中國(guó)藥典2010年版一部》重金屬檢查法（附錄ⅨE）和砷鹽檢查法（附錄ⅨF）對(duì)紅芪膠囊樣品進(jìn)行檢查。

2.8.1 重金屬檢查：重金屬檢查結(jié)果分析顯示：3批紅芪膠囊內(nèi)容物重金屬含量未超過(guò)百萬(wàn)分之十標(biāo)準(zhǔn)比色管，可見(jiàn)本品含量不超過(guò)百萬(wàn)分之十，根據(jù)中藥新藥對(duì)重金屬的限度要求，在允許的范圍之內(nèi)。

2.8.2 砷鹽限量檢查：砷鹽限量檢查結(jié)果分析顯示：3批樣品內(nèi)容物砷鹽含量均未超過(guò)百萬(wàn)分之二，根據(jù)中藥新藥砷鹽的限度要求，本品的砷鹽含量測(cè)定結(jié)果不作為質(zhì)量控制指標(biāo)。

圖4 3批紅芪膠囊樣品中砷鹽檢查結(jié)果

3 討 論 隨著地球環(huán)境污染的惡化，天然植物藥物的生存受到一定程度的威脅，而本品所用藥材的原產(chǎn)地、藥材粗加工中不可避免地會(huì)攝入自然條件下的（如空氣、水源、土壤）及后續(xù)工藝流程中對(duì)人體健康的有害成分。那么藥材安全已經(jīng)成為市場(chǎng)準(zhǔn)入的關(guān)鍵，針對(duì)中藥材及中藥制劑進(jìn)行重金屬、砷鹽的測(cè)定評(píng)價(jià)藥品安全性具有十分重要的意義。

為了尋找療效佳、毒性低、便于臨床使用治療放射損傷疾病的藥物，我教研室根據(jù)中藥理論、中藥屬性及在“君臣佐使”的組方原則下，根據(jù)中醫(yī)辨證施治的理論，研制出一種治療放射損傷疾病的輻射防護(hù)中藥紅芪膠囊。根據(jù)國(guó)家中藥新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，本品內(nèi)容物重金屬、砷鹽限量檢查，均符合國(guó)家藥典規(guī)定之標(biāo)準(zhǔn)。藥品安全是國(guó)家藥典的強(qiáng)制性檢測(cè)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)室檢查證明藥材的原材料購(gòu)置及后續(xù)加工藝流程等環(huán)節(jié)安全可靠。對(duì)該藥進(jìn)行了薄層色譜等是對(duì)藥物成分進(jìn)行鑒別，甄別藥物有效成分是對(duì)藥物基本藥效的認(rèn)證。所以對(duì)紅芪膠囊中紅景天及黃芪的薄層色譜進(jìn)行了鑒別，結(jié)果為：薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離效果良好，確保了藥效多靶點(diǎn)作用的特性。經(jīng)過(guò)高效液相色譜及HPLC色譜條件測(cè)定，紅景天膠囊保留時(shí)間適合，能與其它有效成分進(jìn)行較好地分離。用上述HPLC 色譜條件測(cè)定紅景天膠囊含量，在0.10～1.50mg／mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率高，可作為紅芪膠囊中質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)對(duì)本品各項(xiàng)指標(biāo)的考察，確定的定性、定量方法，經(jīng)過(guò)多批樣品進(jìn)行反復(fù)測(cè)定，為紅芪膠囊進(jìn)入臨床試藥前提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法可靠，準(zhǔn)確性好，符合國(guó)家藥典及藥品臨床準(zhǔn)入之規(guī)定，可用于該膠囊的質(zhì)量控制。

［1］ 李予蓉，譚 娟，王 晉，等.紅芪膠囊對(duì)60Co－γ射線輻射后大鼠腦、肺、血清SOD 活性和MDA 含量的影響［J］.陜西中醫(yī)，2010，（31）：363－364.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1.

［3］ 徐曉瑩，李寶明，何麗一，等.紅景天中紅景甙的薄層光密度測(cè)定法研究［J］.藥物分析雜志，1996，16（4）：272.

［4］ 吳少雄，柳陳堅(jiān)，郭亞?wèn)|，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方紅景天膠囊中紅景天苷的含量［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2008，29（6）：52－53.