兔自體脂肪來源干細(xì)胞對增生性瘢痕的作用研究

卞媛媛，梁久龍，韓 悅，劉曉燕

瘢痕是皮膚組織創(chuàng)傷修復(fù)后的必然產(chǎn)物，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚，組織學(xué)上以成纖維細(xì)胞過度增生和細(xì)胞外基質(zhì)的過度聚集為特征[1]。增生性瘢痕是創(chuàng)傷后修復(fù)異常的一種表現(xiàn)，屬于一種病理性瘢痕。增厚的瘢痕組織不僅嚴(yán)重影響外觀，且后期常發(fā)生攣縮，導(dǎo)致組織器官移位變形，位于關(guān)節(jié)功能部位時常出現(xiàn)功能障礙[2]。目前常用的治療方法有：手術(shù)切除、持續(xù)加壓療法、放射療法、冷凍療法、激光療法、硅凝膠片敷貼法、藥物治療、生長因子相關(guān)藥物、基因療法[3]。亦可多種療法聯(lián)合使用，但效果并不理想。

Morris 等[4]在對兔耳創(chuàng)面研究過程中發(fā)現(xiàn)，在兔耳的急性、慢性創(chuàng)面上可以發(fā)生類似人類增生性瘢痕樣的改變。李薈元等[5]經(jīng)過對數(shù)十只日本大耳白兔雙耳近400 個創(chuàng)面的觀察，開展了建立增生性瘢痕動物實驗?zāi)Ｐ偷南盗醒芯浚剿魍枚诓煌瑒?chuàng)傷條件下形成的增生與人類增生性瘢痕的相似性，并探討其成為增生性瘢痕動物模型的可能性。

2001 年Zuk 等[6]首次從人抽脂術(shù)中抽取的脂肪組織懸液中分離獲得了多向分化干細(xì)胞。脂肪來源干細(xì)胞（ASCs）是脂肪組織中的一種“半成品” 細(xì)胞[7]，具有一般干細(xì)胞的特點，可以自我更新繁殖，同時也可以分化成各種各樣的祖細(xì)胞，后者又可進(jìn)一步成熟發(fā)展成許多有特定功能的細(xì)胞系。ASCs 所具有的修復(fù)、替代和再生的能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個發(fā)展新療法的機(jī)會[8]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 健康雄性新西蘭大耳白兔12 只（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供），體重2 ～2.5 kg，平均月齡4 個月。

1.1.2 主要試劑和儀器 Ⅰ型膠原酶（Invitrogen 公司），胰蛋白酶（HyClone 公司），DMEM 培養(yǎng)基（HyClone 公司），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（HyClone 公司），鈣鹽染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），油紅O 染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。二氧化碳孵箱（日本Sanyo 公司），實驗數(shù)碼攝像顯微鏡（日本Olympus 公司），超凈工作臺（香港 Heal Force 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 ASCs 的提取、原代培養(yǎng)和傳代[9]取大耳白兔稱重，速麻安（0.1 ml/kg）肌內(nèi)注射，待麻醉滿意后于兔左側(cè)腹股溝處皮膚備皮，切開約3 cm 切口，結(jié)扎出血點，暴露脂肪墊。用眼科剪剪下脂肪，去除外包膜和明顯的結(jié)締組織，剔除血管，用含抗生素的PBS 沖洗，將脂肪裝于無菌離心管中，剪碎脂肪，加入1 mg/ml Ⅰ型膠原酶10 ml 消化，37 ℃搖床45 min，見脂肪被消化，離心管內(nèi)液體呈黏稠狀，1 000 r/min 離心10 min,棄上層液體，加入培養(yǎng)液（含100 ml/L 胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基），搖勻，200 目紗網(wǎng)過濾，濾液裝入培養(yǎng)皿。含10%胎牛血清DMEM 的培養(yǎng)液，10 萬U/L 青霉素。37 ℃、5%飽和水氣二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d 換液1 次。傳代：吸出培養(yǎng)液，用PBS 漂洗細(xì)胞1 次，加入0.25%胰酶1 ml，二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)3 ～5 min 使細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿，加入新鮮培養(yǎng)液，終止消化，反復(fù)吹打，使細(xì)胞懸浮按1∶3 傳代率進(jìn)行傳代。

1.2.2 瘢痕模型建立 設(shè)白兔左耳為實驗組，右耳為對照組。于兔耳腹側(cè)設(shè)計直徑為1 cm 的圓形術(shù)區(qū)，每只兔耳共設(shè)計4 個圓形缺損，每個缺損之間間隔距離為2 cm 左右。先用美藍(lán)設(shè)計直徑1 cm 的圓形術(shù)區(qū)，然后于術(shù)區(qū)周圍注射生理鹽水，層次為軟骨膜上層，然后用手術(shù)刀沿術(shù)區(qū)切開至軟骨上層次，提起皮膚，用眼科剪銳性分離，剔除皮膚及皮下組織，暴露軟骨，并剔除軟骨膜，徹底止血，油紗保護(hù)創(chuàng)面。

1.2.3 ASCs 鑒定 ①ASCs 誘導(dǎo)成脂：取生長狀態(tài)良好的第3 代ASCs，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中置入無菌載玻片，2 d 后鏡下觀察細(xì)胞爬滿載玻片，倒去培養(yǎng)液，PBS 沖洗，緩慢加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10%FBS、胰島素10 μmol/L、地塞米松1 μmmol/L 、吲哚美辛200 μmol/L 及異丁基甲基黃嘌呤0.5 mmol/L），每隔2 d全量更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)第6 天后按半量換液，定向分化誘導(dǎo)2 周后進(jìn)行油紅O 染色。②另取生長狀態(tài)良好的第3 代ASCs，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中置入無菌載玻片，2 d 后鏡下觀察細(xì)胞爬滿載玻片，倒去培養(yǎng)液，PBS 沖洗，改用向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)（含10%FBS、地塞米松0.1 μmol/L、抗壞血酸50 μmol/L和β-甘油磷酸鈉10 mmol/L），2 ～3 d 更換1 次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，定向誘導(dǎo)3 周后行鈣鹽染色定性觀察。

1.2.4 ASCs 注射 采用已經(jīng)培養(yǎng)的并生長活躍的兔ASCs（濃度5×106/ml），于1、7、20 d 對實驗組兔耳增生性瘢痕呈環(huán)形注射兔自體ASCs（最好在軟骨上層次注射），每個圓形創(chuàng)面注射0.2 ml,對照組注射同樣劑量的生理鹽水，于增生最顯著的第35 d 切除兩耳增生性瘢痕，行甲醛固定，石蠟包埋、切片、染色。1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 對數(shù)據(jù)采用配對t 檢驗及方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 干細(xì)胞鑒定結(jié)果

誘導(dǎo)成脂14 d，可見圓形或多邊由小脂滴聚集的脂泡，脂滴為橙紅色（圖1a），誘導(dǎo)成骨21 d，骨中鈣質(zhì)呈黑褐色（圖1b）。

2.2 大體觀察

1 ～2 周兔耳皮膚創(chuàng)面愈合早期增生性瘢痕表現(xiàn)為明顯可觸及的圓形凸起斑塊，質(zhì)硬，色紅。5 周時對照組兔耳瘢痕呈現(xiàn)明顯的增生狀態(tài)（圖2a），實驗組兔耳瘢痕則萎縮平軟，色澤接近正常（圖2b）。

2.3 光鏡下觀察

圖1 兔自體ASCs鑒定結(jié)果

經(jīng)5 周治療后，蘇木精-伊紅(HE)染色切片可見實驗組與對照組增生的肉芽組織均厚于周邊正常皮膚，斑塊內(nèi)有大量的成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和毛細(xì)血管，淺部可見環(huán)形或螺旋樣分布，深部與軟骨平行排列。組織內(nèi)有少量炎性細(xì)胞浸潤，部分切片可見軟骨修復(fù)生長（圖3）；對照組早期真皮乳頭層消失，有膠原沉積，真皮淺層膠原纖維呈結(jié)節(jié)或旋渦狀排列；后期真皮以膠原纖維聚集為主，呈雜亂無序的堆積，其間未見明顯毛囊、汗腺等皮膚附屬器的結(jié)構(gòu)；VanGieson染色切片兩組膠原均染成紅色，對照組真皮層中有大量排列無序的成纖維細(xì)胞，細(xì)胞核深染，大量膠原沉積，呈結(jié)節(jié)或旋渦狀，間質(zhì)中可見增生的毛細(xì)血管及炎性細(xì)胞浸潤，實驗組膠原形態(tài)纖細(xì)，排列比較規(guī)則，漩渦結(jié)構(gòu)及炎性細(xì)胞浸潤不明顯（圖4）。

2.4 瘢痕增生指數(shù)、成纖維細(xì)胞密度和膠原纖維面密度比較

瘢痕增生指數(shù)（HI）計算：HI=A/B(A：低倍鏡下用顯微鏡測量尺測量增生的瘢痕厚度，B：周圍正常皮膚厚度)；成纖維細(xì)胞密度（NA）計算：400倍光鏡下觀察HE、VanGieson 染色切片，在瘢痕中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取10 個矩形視野，目測計數(shù)并計算切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果取均數(shù)；膠原纖維面密度（AA）計算：觀察VanGieson 染色組織切片，在瘢痕中央淺部、深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取10 個視野，利用計算機(jī)輔助病理圖像分析系統(tǒng)計算紅染膠原的面密度，結(jié)果取均數(shù)。經(jīng)方差分析，2 組間瘢痕增生指數(shù)，成纖維細(xì)胞密度和膠原纖維面密度均數(shù)不完全相等（P ＜0.05），實驗組顯著低于對照組（P ＜0.01）（表1）。

3 討論

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)人體脂肪組織提取物中存在一些類似于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞，其具有向多種組織分化的潛能，并稱之為脂肪干細(xì)胞[9]。它在體外培養(yǎng)擴(kuò)增迅速，目前已證實此種干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌源性細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，是組織工程重要的種子細(xì)胞之一[10,11]。

表1 兩組瘢痕增生指數(shù)、成纖維細(xì)胞密度和膠原面密度比較（±s）

表1 兩組瘢痕增生指數(shù)、成纖維細(xì)胞密度和膠原面密度比較（±s）

膠原面密度（%）實驗組1. 78 ± 0.133591.2 ± 213.2 28.01 ± 10.22對照組3. 25 ± 0.634238.2 ± 546.6 40.03 ± 12.12組 別瘢痕增生指數(shù)細(xì)胞密度（個/mm2)

成體干細(xì)胞的可塑性是目前臨床治療性應(yīng)用的基礎(chǔ)，但一直備受爭議。特別是2002 年Nature 雜志發(fā)表了Terada 和Ying 等將標(biāo)記有綠色熒光蛋白（GFP)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)與胚胎干細(xì)胞（ES)進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察到形成GFP+ES 樣細(xì)胞后，這種爭論與質(zhì)疑便進(jìn)一步受到人們的關(guān)注，并引發(fā)了相關(guān)論戰(zhàn)。但在爭論的背后，臨床的某些領(lǐng)域，如心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、下肢缺血性疾病治療等，已在利用這一特性進(jìn)行相關(guān)的治療研究，且有報道已取得了喜人的治療效果。在皮膚燒創(chuàng)傷領(lǐng)域，利用成體干細(xì)胞的可塑性進(jìn)行的治療性研究主要集中在誘導(dǎo)皮膚表皮干細(xì)胞以及應(yīng)用MSC 重建汗腺、皮脂腺以及毛囊等方面，最終達(dá)到減少瘢痕形成和實現(xiàn)皮膚功能性修復(fù)的目的[12]。

本實驗對6 只雄性大白兔進(jìn)行了脂肪來源干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)，并成功誘導(dǎo)分化成脂和成骨。我們又根據(jù)李薈元等的方法在12 只兔的24 只兔耳上成功建立了96 個兔耳增生性瘢痕模型。利用提取的生長良好的第3 代干細(xì)胞對瘢痕進(jìn)行研究性應(yīng)用治療，最后于實驗增生最顯著的第35 天切除兩耳增生性瘢痕，并行甲醛固定，石蠟包埋、切片、染色。通過一系列觀察我們發(fā)現(xiàn)，局部注射自體ASCs 能減輕兔耳瘢痕的增生程度，使其變軟、變平。經(jīng)過測量與計算，瘢痕增生指數(shù)顯著下降，瘢痕體積縮小。我們認(rèn)為這可能與干細(xì)胞可以進(jìn)行誘導(dǎo)分化，進(jìn)而為修復(fù)各種組織缺損提供精確指導(dǎo)，真正是“缺什么就補什么”，為臨床治療瘢痕提供了一個新視角，新方法。

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