上海市普陀區(qū)人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)及感染情況分析

周宏 單詠梅 楊凡 萬海英

上海市普陀區(qū)人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)及感染情況分析

周宏 單詠梅 楊凡 萬海英★

目的 探討上海普陀區(qū)婦女宮頸人乳頭瘤病毒（HPV）感染亞型及其分布情況。 方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體外擴(kuò)增和反向斑點(diǎn)雜交-基因芯片技術(shù)，檢測(cè)2012年1月至2013年4月連續(xù)收集的共659例在本院門診就診婦女的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本。 結(jié)果 659例臨床標(biāo)本中共檢出HPV感染340例，總檢出率為51.6%。21種亞型中共檢出20種亞型，其中HPV43低危亞型沒有檢出。感染率居前5位的基因型分別是16型為15.2%、CP8304型為10.2%、6型為8.9%、52型為8.9%、58型為8.4%。單一亞型感染比率為68%，多重感染為32%。20歲以下年齡組、20～29歲、30～39歲、40～49歲、50歲及以上年齡組HPV檢出率分別為53.3%，60.7%，48.6%，36.6% 及 57.8%。高危亞型人群中，HPV主要檢出亞型為16型、CP8304型、6型、52型及58型。 結(jié)論 29歲及以下年齡組檢出高陽性率說明HPV感染有年輕化的傾向，其中16型、52型、58型等高危型HPV感染是本地區(qū)宮頸癌發(fā)病的主要原因。

人乳頭瘤病毒；基因芯片；宮頸癌

人類乳頭狀瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是一類特異感染人類的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞的閉合環(huán)狀雙鏈DNA病毒（double strand DNA，ds-DNA），具有嚴(yán)格的宿主范圍和組織特異性，可以通過多種途徑感染生殖道，導(dǎo)致尖銳濕疣以及宮頸病變，甚至可能引起宮頸癌。從高危型HPV的持續(xù)感染到一般的宮頸癌前病變并最終發(fā)展為宮頸癌大約需要5～10年。因此，有針對(duì)性地進(jìn)行HPV分型檢測(cè)，對(duì)于宮頸癌的早期診斷和治療具有重要意義?，F(xiàn)將2012年1月至2013年4月在本院就診的 659 例婦女宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行HPV分型檢測(cè)，結(jié)果分析如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

659例臨床樣本取自2012年1月至2013年4月來本院婦產(chǎn)科或皮膚性病科就診的、有性生活史、自愿接受下生殖道HPV感染分型篩查的婦女，年齡為15～70歲。

1.2 樣本采集

按樣本采集操作規(guī)程將一次性無菌宮頸細(xì)胞采集毛刷深入宮頸外口并順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)4周后，將采樣刷和采樣柄于刷柄折痕處折斷分離，并將采樣刷置于細(xì)胞保存液中，4℃保存，一周內(nèi)檢測(cè)。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑

人乳頭瘤病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（潮州凱普生物化學(xué)有限公司）?？赏瑫r(shí)檢測(cè)21種亞型。包括15種高危亞型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）和6種低危亞型（HPV6、11、42、43、44，CP8304）。

1.3.2 儀器

ABI5700型基因擴(kuò)增儀；凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣本處理

取500 μL臨床標(biāo)本14 000 rpm離心1 min去上清液，加入400 μL溶液Ⅰ（在45℃水浴中預(yù)熱）混勻后干式恒溫器100℃煮15 min，再加入400 μL溶液Ⅱ，混勻后室溫放置2 min，14 000 rpm離心5 min去上清液，室溫放置2 min，加入60 μL溶液Ⅲ充分溶解，取1 μL樣品做PCR檢測(cè)。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系包括Premix 23.25 μL，Taq酶0.75μL，待檢上清液1μL，PCR反應(yīng)總體積為25μL。按試劑盒說明書進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

1.4.3 雜交過程

將PCR產(chǎn)物在95℃加熱5 min后，立即冰水浴2 min，然后按試劑說明書進(jìn)行雜交。

1.4.4 結(jié)果判斷

以HPV基因芯片中兩個(gè)陽性對(duì)照（Biotin對(duì)照點(diǎn)和IC內(nèi)對(duì)照點(diǎn)）部位均出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)成功標(biāo)志。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理不同組別HPV檢出率。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染率及基因型分布

659 例受檢婦女中，共檢出HPV感染340例，總感染率為51.6%。340例HPV亞型陽性標(biāo)本檢出20種亞型，其中低危亞型43型未檢出，HPV-16型為最常見亞型。陽性樣本中各亞型的感染率如圖1所示。

2.2 HPV感染陽性中高危型及低危型的感染率所占比例情況，如表1。

2.3 HPV感染陽性中單一亞型感染與多重亞型感染的感染率，見表2。

圖1 HPV各亞型在陽性樣品中的感染率Figure 1 The infection rates of each subtype in HPV positive samples

表1 HPV感染中高危型及低危型的感染率Table 1 The infection rates of high-risk HPV and low-risk HPV

表2 單一感染和多重感染分布比率（n=340）Table 2 The positive rates of single HPV subtype infection and multiple HPV subtype infection (n=340)

2.4 患者年齡分布與HPV陽性率的情況，見表3。

3 討論

HPV病毒是一種球形DNA病毒，屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖[1]。目前已分離出130多種，其中約有20種亞型與人類生殖區(qū)皮膚黏膜病變有關(guān)。根據(jù)其對(duì)生殖系統(tǒng)致癌危害性，可將HPV基因型分為高危型和低危型。高危型是宮頸癌的主要發(fā)病因素，低危型可以引起良性病變，比如尖銳濕疣等性傳播疾病[2～3]。隨著子宮頸癌HPV流行病學(xué)調(diào)查的開展，越來越多的基因型被列為高危亞型。對(duì)HPV進(jìn)行分型在性病病原學(xué)和腫瘤學(xué)研究方面都有重要意義。

此次受檢標(biāo)本的HPV分型研究發(fā)現(xiàn)：（1）上海市普陀區(qū)HPV總感染率與北京[4]、遼寧[5]、福州[6]等各地的報(bào)道有所差異，其可能原因有：受檢人群差異，醫(yī)務(wù)人員掌握的檢查指征尺度，或者亞型檢測(cè)方法不同。（2）上海普陀區(qū)HPV感染率居前5位的亞型依次為HPV-16、HPV-CP8304、HPV-6、HPV-52、HPV-58，與劉朝圣[4]，王詩卓[5]，宋艷芳[6]等報(bào)道有所差異，說明HPV亞型分布存在一定的地域差異。（3）不同年齡組HPV感染率有差別，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HPV感染高檢出的年齡段為20～29歲和50歲以上年齡組。HPV感染通常通過性行為傳播，HPV感染率的高低取決于人群的年齡和性行為的習(xí)慣。年輕的、性行為活躍的婦女感染率高，感染的高峰年齡在18～28歲[7]。從我院HPV感染情況分析來看，50歲以上年齡組呈現(xiàn)了高檢出率，這個(gè)年齡段的高檢出率可能與人體的免疫功能相關(guān)。（4）多重感染以同時(shí)感染兩個(gè)基因型為多見，同一樣本最多檢出7種亞型，多重感染增加了癌前病變的風(fēng)險(xiǎn)。

本次HPV分型篩查結(jié)果的分析，對(duì)于上海市HPV感染亞型分布情況的研究有重要的參考價(jià)值，對(duì)以后疫苗的研制和宮頸疾病的治療有重要的意義。

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Analysis of human papillomavirus genotype and infection in Putuo District of Shanghai

ZHOU Hong, SHAN Yongmei, YANG Fan, WAN Haiying★
(The Laboratory Medicine of Tongji Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate the human papillomavirus (HPV) infection subtype in females and its distribution in Putuo District, Shanghai. Methods Polymerase chain reaction (PCR) and reverse dot blot hybridization and DNA microarray technology were used to detect 659 cases of cervical cytology specimens that collected from January 2012 to April 2013. Results There were 340 cases of positive HPV in 659 samples, and the detection rate was 51.6%. 20 kinds of subtypes were detected in 21 kinds of known subtypes. The low-risk type HPV-43 had not been detected. The infection rate of the top five genetypes were HPV-16 (15.2%), HPV-CP8304 (10.2%), HPV-6 (8.9%), HPV-52 (8.9%), HPV-58 (8.4%), respectively. Single HPV subtype infection rate was 68%, and multiple HPV subtype infection rate was 32%. The HPV detection rates in different age groups (＜20, 20～29, 30～39, 40～49, ≥50) were 53.3%, 60.7%, 48.6%, 36.6% and 57.8%, respectively. In high-risk groups, the main HPV subtypes were HPV-16, HPV-CP8304, HPV-6, HPV-52 and HPV-58. Conclusion The high positive rate in age groups of ＜20 and 20～29 illustrated that the HPV infection tend to younger. The high-risk type HPV-16, HPV-52 and HPV-58 played a major role in cervical cancer occurrence and development in local area.

HPV; Gene chip; Cervical cancer

表3 患者年齡分布與HPV陽性率的情況Table 3 HPV positive rates in different age groups

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200065

★通訊作者：萬海英，E-mail:WHYSZ@163.com