生活方式干預(yù)與細(xì)胞免疫功能的相關(guān)性研究

石婷婷曾麗英★莫蕓羅旋景尉鐘惠珠何桂兒

生活方式干預(yù)與細(xì)胞免疫功能的相關(guān)性研究

石婷婷1曾麗英1★莫蕓2羅旋1景尉1鐘惠珠3何桂兒4

目的 探討健康生活模式對(duì)機(jī)體自然清除HPV病毒的價(jià)值。 方法 對(duì)HPV感染者隨機(jī)分為干預(yù)生活方式實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行宮頸分泌物T淋巴細(xì)胞及其亞群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）定量檢測(cè)，半年后復(fù)查宮頸HPV病毒和宮頸分泌物T淋巴細(xì)胞及其亞群定量檢測(cè)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組的HPV病毒清除顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在干預(yù)治療前CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+組間均無顯著性差異；實(shí)驗(yàn)組干預(yù)治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較實(shí)驗(yàn)前顯著升高（P＜0.01），而CD8+顯著下降（P＜0.01）；對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)前后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均無顯著性差異（P＞0.05）。 結(jié)論 對(duì)HPV感染者進(jìn)行生活方式干預(yù)治療，有助于患者免疫能力的改善和病毒的清除，降低宮頸癌病變和宮頸癌的發(fā)生。

HPV感染；自然清除；T淋巴細(xì)胞

眾所周知，宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性身體的健康和生命，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年有近50萬新發(fā)病例，而總體5年生存率在5%左右[1]。已有研究證明99%的宮頸癌組織中可檢出人類乳頭狀病毒（Human Papillomavirus, HPV），HPV感染尤其是高危型HPV持續(xù)性感染是宮頸癌前病變和宮頸癌發(fā)生的必要條件；女性一生中曾HPV感染高達(dá)80%[2]。雖然大多數(shù)HPV感染者能在一定的時(shí)間內(nèi)把體內(nèi)的病毒自然清除掉，但是有少數(shù)的患者持續(xù)感染最終演變成宮頸癌前病變和宮頸癌，所以也可以說宮頸癌是一種感染性疾病，但由于病毒的變異及其本身的特殊結(jié)構(gòu)，使目前對(duì)HPV的感染尚無特殊有效的藥物治療，必須依靠機(jī)體天然的免疫力去清除體內(nèi)的病毒。在正常情況下，當(dāng)機(jī)體遭受病原體入侵以后，必然產(chǎn)生免疫應(yīng)答，即產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及分泌抗體B淋巴細(xì)胞，以阻止感染和清除被感染的細(xì)胞。大量的臨床經(jīng)驗(yàn)證明，相同的感染條件下，機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱決定著疾病的轉(zhuǎn)歸。本研究組擬對(duì)HPV感染者的生活方式進(jìn)行干預(yù)，以探討干預(yù)治療方式對(duì)改善機(jī)體的免疫抵抗力，提高宮頸分泌物中T淋巴細(xì)胞的含量而使機(jī)體具有清除HPV的臨床價(jià)值，從而阻斷宮頸癌前病變和宮頸癌的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇2010年9月～2012年9月我院婦科門診普查發(fā)現(xiàn)的HPV陽性感染者258例，并排除自身免疫性疾病、其他生殖道病毒感染、腫瘤、糖尿病及結(jié)核等可能影響機(jī)體免疫力的疾病，所有患者就診前均未接受任何針對(duì)該病的物理及化學(xué)藥物治療，按就診日期隨機(jī)分組，其中生活方式干預(yù)實(shí)驗(yàn)組158例，非干預(yù)對(duì)照組100例。生活方式干預(yù)：（1）每周至少有氧運(yùn)動(dòng)4次，每次半小時(shí)以上；（2）每天安安靜靜聽自己喜歡的音樂半小時(shí)以上；（3）按時(shí)睡眠，每天23:00之前進(jìn)入睡眠；（4）不吸煙，不酗酒；（5）如果不能按要求做到的患者，退出實(shí)驗(yàn)組；（6）利用先進(jìn)的通訊工具，每半個(gè)月溫馨提醒一次實(shí)驗(yàn)者嚴(yán)格按照質(zhì)量完成生活方式干預(yù)的措施。

1.2 方法

所有HPV陽性的患者均用無菌拭子采集宮頸分泌物置于無菌試管中，獲得宮頸脫落細(xì)胞，進(jìn)行宮頸分泌物T淋巴細(xì)胞及其亞群檢測(cè)，然后隨機(jī)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M。半年后所有患者均復(fù)查宮頸分泌物HPV病毒和T淋巴細(xì)胞及其亞群檢測(cè)。

1.2.1 T淋巴細(xì)胞及其亞群檢測(cè)

本研究中T淋巴細(xì)胞及其亞群采用流式細(xì)胞術(shù)，選用美國BD公司BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀及其配套試劑檢測(cè)。操作方法：（1）取流式細(xì)胞儀專用的12 mm×75 mm試管（Falcon管），按標(biāo)本順序編號(hào)。（2）給試管里面加入2 mL PBS，將分泌物拭子在PBS里面來回混蕩，盡量將拭子上的細(xì)胞混散在PBS里面，弄完后200 g離心力離心5 min，倒掉上清液。（3）給試管里面加入10 μL 抗體，混勻避光孵育30 min，時(shí)間到后加入2 mL PBS，200 g離心力離心5 min，倒掉上清液，然后加入450 μL的1%多聚甲醛固定液，即可上機(jī)檢測(cè)，如不能及時(shí)檢測(cè)，可放4℃冰箱24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 HPV DNA熒光定量PCR

采用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，選用儀器為Applied Biosystems公司的7500 Real-Time system，試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。所使用引物為：正向引物5'-GTTATCGCCTCCCCCAAAT-3'，反向引物5'-ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG-3'。操作方法：（1）標(biāo)本處理：將粘有分泌物的棉拭子置于1 mL生理鹽水中充分震蕩搖勻，擠干棉拭子中的水分，棄棉拭子，轉(zhuǎn)移液體至離心管中，12 000 rpm離心5 min，棄盡上清，重復(fù)洗滌一次后，在沉淀中加入50μL DNA提取液，充分混勻，100℃沸水浴10 min， 10 000 rpm離心5 min，取上清2 μL做PCR反應(yīng)。（2）PCR反應(yīng)：按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及Taq酶，充分混勻后按43 μL/管分裝至0.2 mL離心管中備用。取準(zhǔn)備好的試劑于0.2 mL離心管中，加入處理后的樣品上清液2 μL，8 000 rpm離心數(shù)秒按下列條件擴(kuò)增：93℃ 2 min預(yù)變性，然后按93℃ 45 s→55℃60 s做10個(gè)循環(huán)，93℃ 30 s→55℃ 45 s做30個(gè)循環(huán)。（3）Real-Time system檢測(cè)分析：設(shè)置好分析條件，在Analysis菜單下選擇Analyze自動(dòng)分析結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間、治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 宮頸分泌物中T淋巴細(xì)胞及其亞群的結(jié)果

通過流式細(xì)胞分析儀對(duì)宮頸分泌物中的淋巴細(xì)胞含量及其亞群進(jìn)行分析，可由檢測(cè)系統(tǒng)直接計(jì)算得到。本研究采用的檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示見圖1，提示該樣本的T淋巴細(xì)胞Gate值為15%，在總細(xì)胞比例為15%。其中CD3+的Gate值為23.72%，CD3+CD8+的Gate值為10.7%，CD3+CD4+的Gate值11.63%。

2.2 宮頸分泌物中HPV病毒定量檢測(cè)結(jié)果曲線圖

HPV病毒定量的結(jié)果判定主要依據(jù)增長曲線和CT值，當(dāng)增長曲線不成S型或CT值為30，HPV病毒含量低于檢測(cè)范圍，視為陰性。反之當(dāng)增長曲線成S型或CT值小于30，HPV病毒視為陽性。檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示見圖2，該標(biāo)本的增長曲線為S型，CT值約為15，提示為強(qiáng)陽性結(jié)果。

2.3 實(shí)驗(yàn)前后宮頸分泌物中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+含量情況

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在生活方式干預(yù)治療前CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+組間均無顯著性差異；實(shí)驗(yàn)組干預(yù)治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較實(shí)驗(yàn)前顯著升高（P＜0.01），而CD8+則顯著下降（P＜0.01）；對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)前后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

2.4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HPV感染轉(zhuǎn)陰性情況

圖1 T淋巴細(xì)胞及其亞群檢測(cè)結(jié)果Figure 1 The test results of T lymphocytes and its subtypes

實(shí)驗(yàn)組的HPV患者轉(zhuǎn)陰比例46.2%顯著高于對(duì)照組的27.0%，表明實(shí)驗(yàn)組的HPV病毒清除率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表 2。在治療前，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在數(shù)量和比例上無顯著性差異，提示宮頸局部的免疫功能相當(dāng)。在實(shí)驗(yàn)前后，對(duì)照組T淋巴細(xì)胞及其亞群在數(shù)量和比例上基本保持不變，尤其是CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞無顯著性差異，表明宮頸局部的免疫功能并無改變。經(jīng)過生活方式干預(yù)療法之后，實(shí)驗(yàn)組T淋巴細(xì)胞的含量有顯著性改變，發(fā)揮抗腫瘤作用的CD4+含量顯著性增加，抑制機(jī)體抗腫瘤作用的CD8+含量顯著性降低，兩者的比例顯著性升高，表明宮頸組織局部免疫力得到增強(qiáng)。這個(gè)結(jié)果也充分印證了表2數(shù)據(jù)出現(xiàn)的必然性。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，可以得知健康的生活模式確實(shí)能夠提高宮頸組織局部免疫力。

3 討論

當(dāng)HPV病毒入侵機(jī)體時(shí)，機(jī)體會(huì)及時(shí)啟動(dòng)自身免疫系統(tǒng)，而T淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著中心調(diào)控作用，是機(jī)體免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞[3～4]，它所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在殺傷腫瘤細(xì)胞、控制腫瘤生長中起重要作用[5]。當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)與病毒抗?fàn)幨r(shí)，T淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)量、功能會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致 HPV持續(xù)性感染乃至誘導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

圖2 宮頸分泌物中HPV病毒定量檢測(cè)結(jié)果曲線圖Figure 2 Graph of quantitative determination with HPV in cervical secretions

表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HPV感染轉(zhuǎn)陰性情況比較Table 2 Compared of the HPV negative infection in intervention group and control group

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后宮頸分泌物中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的變化Table 1 Change in cervical secretions of CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+in intervention group and control group before and after experiment

T淋巴細(xì)胞在胸腺發(fā)育過程中，產(chǎn)生了 CD4+和CD8+兩大亞群[6]。兩大亞群在抗腫瘤反應(yīng)中作用各不相同，但相互協(xié)調(diào)、相互制約，共同參與對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，反映了機(jī)體抗腫瘤免疫狀態(tài)的總體水平[7]。有研究表明，T 淋巴細(xì)胞亞群狀態(tài)異常和比例失調(diào)的現(xiàn)象，在混合多種腫瘤患者中較為明顯[8～10]。與正常人相比，宮頸癌患者 T淋巴細(xì)胞中CD4+細(xì)胞減少、CD8+細(xì)胞升高，CD4+/CD8+降低。Passmore等[11]研究證實(shí)，宮頸處和血液中的CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞對(duì) HPV16 E7抗原的反應(yīng)強(qiáng)度相似，且有明顯相關(guān)性。在宮頸癌及其癌前病變的腫瘤微環(huán)境中，CD4+細(xì)胞逐漸減少，輔助細(xì)胞免疫及體液免疫的作用受到影響，T細(xì)胞各亞群之間平衡紊亂，抑制了機(jī)體的抗腫瘤免疫，上述情況破壞了宮頸組織局部免疫微環(huán)境的平衡，最終導(dǎo)致宮頸病變，也有利于腫瘤的進(jìn)展、侵襲或轉(zhuǎn)移。所以，在宮頸癌研究中，研究人員需要關(guān)注宮頸局部的免疫功能改變，并分析其對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的影響。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行生活方式干預(yù)后宮頸分泌物CD3+、CD4+水平升高：CD3+T（總T細(xì)胞淋巴細(xì)胞）、CD4+T（輔助性T細(xì)胞/Th）升高，細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)；CD8+水平下降：CD8+T（細(xì)胞毒性T細(xì)胞/Tc和抑制性T細(xì)胞/Ts）下降，免疫抑制作用減弱，提示機(jī)體局部免疫作用增強(qiáng)，有利于對(duì)HPV病毒的自然清除。故我們對(duì)所有的患者均進(jìn)行了HPV病毒的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，實(shí)驗(yàn)組的HPV清除率顯著高于對(duì)照組。從這兩個(gè)不同方面的檢測(cè)結(jié)果來看，它們之間也是相互印證的，更有力的支持實(shí)驗(yàn)組宮頸局部的免疫力得到增強(qiáng)的這個(gè)結(jié)論。綜上所述，增強(qiáng)宮頸局部的免疫功能就能提高人體對(duì)HPV病毒的自然清除。

本研究試行的生活方式從運(yùn)動(dòng)、心境、睡眠等幾個(gè)方面來改善生活質(zhì)量，提倡進(jìn)行適宜的運(yùn)動(dòng)、動(dòng)靜結(jié)合、充足的睡眠和輕松愉快的音樂環(huán)境等，這些措施是希望可以使人在疲勞中恢復(fù)過來，使受損的細(xì)胞恢復(fù)，從而發(fā)揮其免疫功能，提示我們良好的生活方式有助于全面提高人體的免疫力，增強(qiáng)對(duì)各種致病因素的清除。而由于目前國內(nèi)外并無宮頸移行帶T淋巴細(xì)胞含量的參考值，甚至關(guān)于宮頸移行帶T淋巴細(xì)胞的報(bào)道都很少，所以本研究還有待進(jìn)一步的深入，但本研究希望能通過一種積極的生活態(tài)度、良好的生活習(xí)慣來提高人們的免疫力，增強(qiáng)對(duì)癌癥的戰(zhàn)斗力。

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A study of the association between life style intervention and cellular immune function

SHI Tingting1, ZENG Liying1★MO Yun2, LUO Xuan1, JING Wei1, ZHONG Huizhu3, HE Guier4
(1.Department of Clinical Laboratory, Yuexiu Maternity & Child Health Care Hospital, Guangdong, Guangzhou 510055, China; 2.Department of Gynaecology and Obstetrics, Yuexiu Maternity & Child Health Care Hospital, Guangdong, Guangzhou 510055, China; 3.Department of Clinical Laboratory, Guangzhou Maternity & Child Medical Center, Guangdong, Guangzhou 510620, China; 4.Department of Clinical Laboratory, Hexian Memorial Hospital, Guangdong, Guangzhou 511400, China)

Objective To investigate the effect of life style intervention on the ability of immune system to clear up HPV. Methods 258 patients with histologically confirmed HPV infection were recruited and randomly divided into intervention group and control group. Samples of cervical secretion were collected and total T lymphocytes and its subgroups and HPV were quantified using flowcytometry and real time PCR respectively. The measurement was repeated after 6 months. Results HPV clearance in the intervention group was significantly higher than the control group (P＜0.01). No difference was identified between the two groups regarding the total and subgroups of T lymphocytes. Additionally, the treatment could significantly improve the counts of T lymphocytes in the intervention group (P＜0.01), while such effect was not observed in the control group. Conclusion Life-style intervention could improve the immune function and help to clear up the viruses in the HPV-infected patients.

HPV infection; Spontaneous clearance; T lymphocytes

廣東省廣州市越秀區(qū)科技和信息化局醫(yī)療衛(wèi)生類基金（2010-WS-006）

1.越秀區(qū)婦幼保健院，檢驗(yàn)科，廣東，廣州 510055 2.越秀區(qū)婦幼保健院，婦產(chǎn)科，廣東，廣州 510055 3.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，檢驗(yàn)科，廣東，廣州 510620 4.番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院，檢驗(yàn)科，廣東，廣州 511400

★通訊作者：曾麗英，E-mail:18925029249@189.cn