產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及其紫外誘變

張學(xué)佳,田 云,盧向陽

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙410128;2.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所,湖南長沙410128)

產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及其紫外誘變

張學(xué)佳1,2,田 云1,2,盧向陽1,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙410128;2.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所,湖南長沙410128)

采用剛果紅脫色圈法初篩得到143株有纖維素酶活性的細(xì)菌,然后采用DNS法復(fù)篩得到纖維素酶酶活最高的6株細(xì)菌,進(jìn)一步進(jìn)行紫外誘變處理,獲得酶活提高最大且具有遺傳穩(wěn)定性的菌株E140′,酶活為0.90 IU·m L-1,較出發(fā)菌株(0.68 IU·m L-1)提高了32.35%。表明采用剛果紅脫色圈法和DNS法聯(lián)合篩選并結(jié)合紫外誘變,可以獲得纖維素酶活性高的細(xì)菌。

剛果紅;DNS;紫外誘變;纖維素酶

纖維素酶可以將纖維素降解為小分子糖,甚至單糖(葡萄糖等),實(shí)現(xiàn)廢物利用。獲得更高活性的纖維素酶,能大幅降低成本,改進(jìn)工藝流程[1-3],將對(duì)生物質(zhì)能源、造紙、發(fā)酵、紡織、洗滌等行業(yè)產(chǎn)生巨大影響。

自然界生物種類繁多,天然的纖維素酶種類及數(shù)量龐大,其活性也各不相同。如何快速有效地篩選獲得高活性的纖維素酶及產(chǎn)酶菌株成為了研究的熱點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

細(xì)菌菌種來自于黃牛的牛糞及牛胃內(nèi)容物、黑山羊羊糞、腐木木屑、多年生喬木根系附近的土壤。

CMC-Na篩選培養(yǎng)基(g·L-1):CMC-Na 5,蛋白胨10,氯化鈉10,酵母提取物5,瓊脂糖12。

細(xì)菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g·L-1):麩皮40,蛋白胨20, K2HPO410,酵母提取物4。

1.2 方法

1.2.1 剛果紅脫色圈法初篩[4-7]

取細(xì)菌菌種1 m L接入裝有CMC-Na篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)8 h后,每小時(shí)觀測(cè)1次,待細(xì)菌長到直徑約0.3～2 cm時(shí),取出培養(yǎng)皿。倒入1%剛果紅染液靜置1 h,倒掉染液。倒入1 mol·L-1的氯化鈉溶液靜置0.5 h,倒掉氯化鈉溶液,觀察有無脫色圈。如果該細(xì)菌能分泌纖維素酶,則有脫色圈;反之,則無。

1.2.2 DNS法復(fù)篩[8]

(1)細(xì)菌粗酶液的制備:取活化的菌種接入裝有細(xì)菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶中,于37℃、140 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h。取1 m L培養(yǎng)液,4000 r·min-1離心10 min。取0.5 m L上清液,即為粗酶液。

(2)采用DNS法,在波長為540 nm處測(cè)定一系列已知濃度葡萄糖的OD值,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)酶活的測(cè)定:取適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 m L于15 m L刻度試管中,加1.5 m L蒸餾水,另取一份置于沸水浴10 min滅活作對(duì)照。加DNS試劑3.0 m L, 50℃水浴30 min,沸水浴5 min,冷卻后用水補(bǔ)足到10 m L,在540 nm波長下測(cè)定OD值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出葡萄糖濃度(μmol·m L-1),計(jì)算粗酶液中糖含量,并按下式計(jì)算酶活:

酶活定義:在自然p H值條件下,1 m L酶液水解底物1 min產(chǎn)生1μmol還原糖所用的酶量為1個(gè)酶活力單位(IU·m L-1)。

1.2.3 紫外誘變

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌,在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)細(xì)菌個(gè)數(shù),稀釋至細(xì)菌濃度為1×108個(gè)·m L-1。取稀釋菌液分別紫外誘變處理0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、105 s、120 s、135 s、150 s,繪制致死率曲線。

以致死率75%～90%之間的時(shí)間作為最佳誘變時(shí)間,對(duì)復(fù)篩得到的菌株進(jìn)行紫外誘變。將誘變菌株進(jìn)行剛果紅脫色圈篩選[9,10]。取脫色圈大的菌株用DNS法檢測(cè)酶活,并將酶活提高的菌株添加50%甘油保存于-20℃冰箱。

1.2.4 酶活穩(wěn)定性鑒定[10,11]

取誘變后粗酶活最高的6株菌,活化。傳代一定代數(shù)以后開始標(biāo)記為0代,以0代為起點(diǎn)接種產(chǎn)生的下一批菌種為第1代,然后以第1代接種產(chǎn)生第2代,如此類推,直到產(chǎn)生第5代菌株,測(cè)定各代菌株的粗酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 初篩結(jié)果

由于細(xì)菌將酶分泌到培養(yǎng)基中,因此脫色圈的大小一定程度上與酶的擴(kuò)散程度相關(guān),受時(shí)間影響(圖1)較大。從圖1可以看出,點(diǎn)樣5 d后的脫色圈直徑大于點(diǎn)樣3 d后的脫色圈直徑。另一方面,由于細(xì)菌菌落增長速度和脫色圈變大速度的不一致(甚至有時(shí)菌落長大到一定程度就幾乎不再增大),采用菌落直徑與脫色圈直徑的比值作為酶活高低評(píng)判的方式也存在一定的理論缺陷。采用剛果紅脫色圈法篩選得到143株有剛果紅脫色圈的細(xì)菌菌株。部分初篩結(jié)果見表1。

圖1 時(shí)間對(duì)脫色圈的影響Fig.1 The influence of time on the decolorizing circle

表1 部分初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Part of primary screening results

2.2 復(fù)篩結(jié)果

對(duì)初篩得到的143株菌進(jìn)行DNS法復(fù)篩,最終選擇DNS法測(cè)得的酶活最高的6株菌株(表1)進(jìn)行紫外誘變實(shí)驗(yàn)。

2.3 紫外誘變結(jié)果

紫外照射時(shí)間與致死率的關(guān)系曲線見圖2。

圖2 紫外照射時(shí)間與致死率的關(guān)系Fig.2 The relationship between the ultraviolet irradiation time and the fatality rate

從圖2可以看出,紫外照射超過120 s以后,致死率接近100%,一般選擇致死率在75%～90%之間進(jìn)行紫外誘變,本實(shí)驗(yàn)選取致死率為83.5%的90 s作為最佳誘變時(shí)間。

將復(fù)篩得到的6株菌分為6組分別紫外誘變處理90 s,將各組酶活最高的誘變菌株分別命名為D1′、A83′、E140′、E17′、D22′、B4′,紫外誘變前后細(xì)菌酶活對(duì)比見表2。

表2 紫外誘變前后細(xì)菌酶活對(duì)比/IU·mL-1Tab.2 The bacterial enzyme activity before and after UV mutagenesis/IU·m L-1

2.4 酶活穩(wěn)定性(表3)

從表3可以看出,E140的紫外誘變菌株E140′的酶活最高,比較穩(wěn)定,且最高酶活為0.90 IU·m L-1,較出發(fā)菌株E140的0.68 IU·m L-1提高了32.35%。

表3 6株誘變菌株的酶活穩(wěn)定性/IU·m L-1Tab.3 Enzyme activity stability of the six mutation strains/IU·m L-1

2.5 討論

剛果紅脫色圈的直徑大小并不能直接反映細(xì)菌纖維素酶活力的高低。當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶但不分泌到培養(yǎng)基時(shí)(即產(chǎn)生的酶附著在細(xì)菌的表面,這種情況比較少),就很難觀察到脫色圈。另外,脫色圈的大小一定程度上與酶的擴(kuò)散程度相關(guān),受時(shí)間影響很大。因此,實(shí)驗(yàn)僅以有無脫色圈作為是否有纖維素酶活性的判斷標(biāo)準(zhǔn)(目的在于篩選去掉沒有纖維素酶活性的其它菌株),而以DNS法測(cè)得的酶活作為酶活高低的判斷標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),脫色圈直徑的大小、脫色圈直徑與菌落直徑的比值,與DNS法測(cè)得的酶酶活性高低并不一致(表1),也說明僅用脫色圈直徑的大小、脫色圈直徑與菌落直徑的比值作為纖維素酶活性的評(píng)價(jià)方法并不可靠。建議,在篩選規(guī)模較大的時(shí)候,以簡單的方法(如剛果紅脫色圈法)進(jìn)行初篩、以復(fù)雜但精確的方法(如DNS法)進(jìn)行復(fù)篩,兼顧篩選的效率并進(jìn)一步擴(kuò)大篩選范圍,以快速獲得更多、更高效的產(chǎn)酶菌株。

3 結(jié)論

通過剛果紅脫色圈法初篩及DNS法復(fù)篩,得到6株纖維素酶酶活最高的細(xì)菌,再經(jīng)紫外誘變處理,獲得了酶活提高32.35%的誘變菌株E140′。表明采用剛果紅脫色圈法和DNS法聯(lián)合篩選并結(jié)合紫外誘變,可以獲得纖維素酶酶活高的細(xì)菌。

[1] 陳洪章.纖維素生物技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011:4-7.

[2] 王祿山,張正,等,譯.纖維素降解的超分子機(jī)器[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011:11-14.

[3] 曲音波,等.木質(zhì)纖維素降解酶與生物煉制[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011:23-24.

[4] Teather R M,Wood P J.Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen[J].Applied and Environmental Microbiology,1982,43(4):777-780.

[5] Hendricks C W,Doyle J D,Hugley B.A new solid medium for enumerating cellulose-utilizing bacteria in soil[J].Applied and Environmental Microbiology,1995,61(5):2016-2019.

[6] 張建峰,耿宏偉,王曙光,等.一株高產(chǎn)纖維素酶菌的篩選[J].食品工程,2010,(10):170-172.

[7] 齊海萍,胡文忠,范圣第,等.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,(3):420-422.

[8] Eveleigh D E,Mandels M,Andreotti R,et al.Measurement of saccharifying cellulase[J].Biotechnology for Biofuels,2009,2(1):21-28.

[9] 焦秀鳳,盛曉莉,單繼陽,等.纖維素分解菌的篩選及其紫外誘變[J].化學(xué)與生物工程,2010,27(1):52-54.

[10] 張秋卓,蔡偉民.纖維素酶高產(chǎn)菌株的復(fù)合交替誘變選育[J].工業(yè)微生物,2008,38(6):32-37.

[11] 桂春燕,陳義倫,謝曉平,等.黃河三角洲耐高滲堿性纖維素酶產(chǎn)生細(xì)菌YRD-19的誘變育種和產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技, 2010,31(10):163-167.

Screening and Ultraviolet Mutagenesis of Cellulase-Producing Bacteria

ZHANG Xue-jia1,2,TIAN Yun1,2,LU Xiang-yang1,2
(1.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Agricultural Bioengineering Research Institute,Changsha 410128,China)

Firstly,143 strains with cellulase activity were obtained by primary screening with Congo red decolorizing ring method,and then 6 strains with the highest enzyme activity were obtained by screening with DNS method.After the furtherly UV mutagenesis treatment,a mutant strain E140′with the highest enzyme activity increasing and genetic stability was got,whose enzyme activity reached 0.90 IU·m L-1,increasing by 32.35%than that of the starting strain(0.68 IU·m L-1).It showed that cellulase-producing bacteria with high enzyme activity could be obtained by screening with both Congo red decolorizing ring method and DNS method, combining with UV mutagenesis treatment.

Congo red;DNS;UV mutagenesis;cellulase

TQ 920.1 Q 936

A

1672-5425(2013)03-0014-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.004

科技部國際科技合作項(xiàng)目(2010DFA62510),教育部2009年度長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT0963)

2012-12-20

張學(xué)佳(1986-),男,湖南益陽人,碩士研究生,主要從事應(yīng)用微生物學(xué)研究,E-mail:zhangxuejia99@163.com;通訊作者:盧向陽,教授,E-mail:xiangyangcn@163.com;田云,副研究員,E-mail:tianyun79616@163.com。