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    白介素-13基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)性研究

    2013-07-17 08:45:58濮海平呂振華林榮軍傅翠捧孫曉梅
    實(shí)用醫(yī)藥雜志 2013年4期
    關(guān)鍵詞:等位基因多態(tài)性基因型

    濮海平,劉 華,呂振華,林榮軍,傅翠捧,孫曉梅

    支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是全球最常見(jiàn)的慢性疾病,在許多地區(qū)近10~20年哮喘患病率增高了1倍[1],并有逐年增高的趨勢(shì)。哮喘為慢性氣道炎癥性疾病,長(zhǎng)期的慢性炎癥直接或間接引起氣道重構(gòu),導(dǎo)致不可逆氣流阻塞,嚴(yán)重影響患者的身心健康。IL-13是近年來(lái)新克隆的Th2型細(xì)胞因子,可通過(guò)募集、歸巢、激活炎性細(xì)胞介導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞(EOS)的集聚和氣道高反應(yīng)性(ARH),而在哮喘的發(fā)生中起重要作用。IL-13可不依賴于其它Th2型細(xì)胞因子及嗜酸粒細(xì)胞IgE介導(dǎo)的途徑而單獨(dú)誘發(fā)哮喘的所有癥狀,是哮喘病理發(fā)生中的關(guān)鍵細(xì)胞因子,IL-13基因多態(tài)性與哮喘的易感性也密切相關(guān)。

    盡管目前在哮喘的治療方面已取得了巨大的進(jìn)展,但由于哮喘發(fā)病率的明顯增加,激素抵抗型哮喘的增多、支氣管擴(kuò)張劑和糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用受到其局部和全身不良反應(yīng)的限制。因此有必要探求治療哮喘的新策略。由于IL-13在哮喘病理發(fā)生中的關(guān)鍵作用,因此IL-13是治療哮喘的新目標(biāo)。近年來(lái),國(guó)外學(xué)者對(duì)IL-13基因多態(tài)性進(jìn)行了深入的研究,發(fā)現(xiàn)IL-13基因多態(tài)性可能與哮喘間存在著密切的關(guān)系,但具體機(jī)制尚未完全明了。筆者對(duì)哮喘患者及正常對(duì)照組兒童IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)C/T采用限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)位點(diǎn)法(RFL Ps)進(jìn)行了基因多態(tài)性的研究,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 對(duì)象 哮喘組:在解放軍401醫(yī)院及青島醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的漢族患者,符合以下條件者納入試驗(yàn):患者必須符合文獻(xiàn)[2]的診斷標(biāo)準(zhǔn),處于哮喘發(fā)作期,2周內(nèi)未使用過(guò)糖皮質(zhì)激素,無(wú)共患疾病,年齡 3~12 歲,平均(5.8±2.9)歲,共 96 例。 健康對(duì)照組:為同期健康查體的同齡漢族兒童,平均 (5.6±2.6)歲,均無(wú)哮喘病史,無(wú)家族及個(gè)人過(guò)敏史者共96名。以上受試者間均無(wú)血緣關(guān)系。

    1.2 主要儀器、試劑及樣本采集

    1.2.1 主要儀器 水平/垂直板式電泳儀Bio-Rad(USA);PCR 儀 Eppendorf(Germany);水平/垂直板式電泳儀 Bio-Rad(USA);酶標(biāo)儀 ELX-800(USA);紫外分光光度計(jì)Beckman DU-640(USA)。

    1.2.2 主要試劑 EDTA-Na2(上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司);瓊脂糖Promega;PCR Marker(華美公司);Taq DNA 聚合酶 Promega;BsaA I限制性內(nèi)切酶 N EB;IgE 試劑盒 (eliza)R&D;IL-13 試劑盒(eliza)R&D;引物合成(上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司)。

    1.2.3 樣本采集 抽取所有受試者靜脈血3 ml,2%乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA)抗凝,2 ml分離血漿-70℃凍存,1 ml用于取外周血白細(xì)胞基因組 (要求采血至分離白細(xì)胞之間隔時(shí)間在室溫下放置不超過(guò)2 h,4℃放置不超過(guò)5 h,以防白細(xì)胞自溶)。

    1.2.4 基因組提取 采用NaI提取法提取外周血白細(xì)胞。取外周抗凝血 (全血)100μl于Ep管中,12 000 r/min離心12 min,棄上清,加雙蒸水200 μl溶解,搖勻 20 s,混勻后加 6M NaI溶液 200 μl,搖勻 20 s,加氯仿/異戊醇(24∶1)400 μl,即加即搖,搖勻 20 s,12 000 r/min 離心 12 min。 取上層液 350 μl,加入另一新Ep管中,加0.6倍體積異丙醇,搖勻20 s,室溫放置15 min,靜置后的反應(yīng)體系15 000 r/min離心12 min,使沉淀緊貼Ep管壁。棄異丙醇,加 70%乙醇溶液1 ml(不振動(dòng)),15 000 r/min離心12 min。棄乙醇,敞開(kāi)Ep管蓋,烘干(37℃恒溫箱)后,加 1×TE 溶液 30 μl,溶解 DNA>12 h 以上,制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 方法

    1.3.1 血漿IL-13、TIgE的測(cè)定 均采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè),嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

    1.3.2 IL-13+1923引物設(shè)計(jì) 引物序列參考文獻(xiàn)[3]:上游引物 5‘-GGACAGGGA CCCACTTCACAC-3’,下游引物 5‘-GCTAACATATTTAATATTTATGT AC-3’。

    1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng) 該反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行,總反應(yīng)體積為 25 μl,80 ng 基因組 DNA,10 mmol/L Tris-HCL (pH8.3),50 mmol/L KCL,1.5 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTP, 上下游引物各 50 ng,1.5UTagDNA聚合酶。反應(yīng)過(guò)程:94℃變性2 min,然后 94℃ 40 s,55℃ 40 s,72℃ 50 s,共 33個(gè)循環(huán);然后72℃延伸10 min。

    1.3.4 IL-13+1923限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)取上述PCR產(chǎn)物10 μl加 BsaA I 5U,37℃酶切過(guò)夜,然后在3%瓊脂糖凝膠上加溴化乙錠(終濃度為0.7 μg/ml),取 8 μl酶切產(chǎn)物在凝膠上上樣電泳,以PCR Markers作為DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)參照物,紫外燈照射下觀察拍照。IL-13+1923位點(diǎn)基因型為:TT基因型出現(xiàn)559 bp 1條帶;CC基因型出現(xiàn)310、249 bp 2條帶;雜合子TC基因型出現(xiàn)559、310、249 bp 3條帶。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用基因計(jì)數(shù)法分別統(tǒng)計(jì)哮喘組和對(duì)照組基因型和等位基因分布頻率,數(shù)據(jù)經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后,用SPSS10.0計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件分析,兩組之間的基因型和等位基因分布頻率顯著性分析用χ2檢驗(yàn),兩組間IL-13、IgE濃度顯著性分析用t檢驗(yàn),不同基因型間血漿總IgE濃度比較用方差分析。

    2 結(jié) 果

    2.1 IL-13基因+1923位點(diǎn)多態(tài)性分析 +1923位點(diǎn)PCR/RFLP結(jié)果見(jiàn)圖1。TC基因型:酶切產(chǎn)物為 559、310、249 bp;CC 基因型酶切產(chǎn)物為 310、249 bp;TT基因型為 559 bp。

    圖 1 IL-13+1923位點(diǎn)不同基因型PCR產(chǎn)物經(jīng)BsaA I酶切分型

    2.2 哮喘組與對(duì)照組+1923位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布比較 按文獻(xiàn)[4]對(duì)哮喘組和對(duì)照組的IL-13基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),吻合度測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明,該位點(diǎn)的基因型期望值和觀察值之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(哮喘組χ2=0.29,P>0.05; 對(duì) 照 組 χ2=0.06,P>0.05), 符 合 Hardy-Weinberg遺傳平衡。這說(shuō)明所取樣本資料具有代表性、可靠。基因型頻率分布:哮喘組與對(duì)照組比較有顯著性差異(χ2=9.85,P<0.01),不同的基因型哮喘的患病率,變異等位基因T攜帶者(TT及CT基因型)患哮喘的危險(xiǎn)性高于非攜帶者 (CC基因型);等位基因頻率分布:兩組之間亦有顯著性差異(χ2=9.27,P<0.01)。 見(jiàn)表 1。

    2.3 IL-13+1923位點(diǎn)不同基因型對(duì)血漿IL-13及TlgE水平的影響 哮喘組中TT、TC基因型人群IL-13及TlgE水平與同組及對(duì)照組CC基因比較均有顯著性差異(P<0.01),見(jiàn)表 2。

    3 討 論

    哮喘是一種以EOS浸潤(rùn)為主的氣道反應(yīng)性炎癥和以AHR為特征的疾病,發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為,氣道炎癥是哮喘AHR的基礎(chǔ),而EOS是其關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞[4]。EOS在哮喘氣道的聚集是哮喘發(fā)作的一個(gè)中間環(huán)節(jié),EOS的浸潤(rùn)是氣道病理的主要特征。IgE是引起哮喘的主要效應(yīng)分子,IgE結(jié)合許多效應(yīng)細(xì)胞(如肥大細(xì)胞,嗜堿性粒細(xì)胞等)表面的受體,引起效應(yīng)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì),導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性,增強(qiáng)黏液分泌和靜脈通透性。IL-13作為Th2型細(xì)胞因子,可通過(guò)EOS炎癥細(xì)胞聚集間接誘導(dǎo)AHR,還可直接誘導(dǎo)AHR。近年來(lái)研究表明,IL-13在誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌IgE中也起重要作用,是體內(nèi)僅有的2種可以直接促進(jìn)IgE合成的細(xì)胞因子之一。IL-13誘導(dǎo)EOS在支氣管黏膜層募集,延長(zhǎng)嗜酸性粒細(xì)胞的的壽命,抑制其凋亡,表明IL-13在哮喘的發(fā)生中起到極其重要的作用[5-7]。筆者通過(guò)對(duì)哮喘患者及正常對(duì)照組兒童IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)C/T采用限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)位點(diǎn)法(RFL Ps)進(jìn)行基因多態(tài)性的研究,結(jié)果顯示,+1923位點(diǎn)三種基因型CC、CT和TT及等位基因C、T的頻率分布在所研究的兩組人群中均存在顯著性差異,且T等位基因攜帶者患哮喘危險(xiǎn)性較非攜帶者高約2倍,這說(shuō)明等位基因T與哮喘關(guān)聯(lián),攜帶T等位基因的個(gè)體具有哮喘易感性。本文結(jié)果還顯示:在哮喘或?qū)φ战M,血漿IgE水平在CC、CT及TT基因型間依次增高,該結(jié)果與這三種基因型個(gè)體患哮喘的危險(xiǎn)性依次增高是一致的,且具有相同基因型的個(gè)體,哮喘患者的IgE水平高于對(duì)照組。這也提示IgE在哮喘發(fā)病中的作用。筆者認(rèn)為,+1923位點(diǎn)不同基因型個(gè)體患哮喘的危險(xiǎn)性不同與該位點(diǎn)不同等位基因所引起的生物學(xué)改變是有一定聯(lián)系的。本文結(jié)果顯示,血漿IL-13水平與IL-13+1923位點(diǎn)C/T基因多態(tài)性有關(guān),當(dāng)IL-13+1923位點(diǎn)為胞嘧啶(C)時(shí),血漿IL-13水平較低,說(shuō)明IL-13 mRNA表達(dá)較少;而當(dāng)IL-13+1923位點(diǎn)為胸腺嘧啶(T)時(shí),血清IL-13水平較高,說(shuō)明IL-13 mRNA表達(dá)較多。這一結(jié)果提示IL-13+1923位點(diǎn)基因多態(tài)性與血清IL-13間存在著密切的關(guān)系。

    IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)基因多態(tài)性影響IL-13 mRNA表達(dá),可能的機(jī)制為:①當(dāng)IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)為胞嘧啶(C)時(shí),甲基化DNA可直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合,阻礙轉(zhuǎn)錄進(jìn)行,而當(dāng)發(fā)生C→T突變時(shí),這種干擾作用消失,轉(zhuǎn)錄速度將加快,IL-13 mRNA增加,且IL-13 mRNA表達(dá)量將增加[8];②5-甲基胞嘧啶能與特異性甲基化DNA蛋白結(jié)合,從而阻斷或取代轉(zhuǎn)錄因子的作用,轉(zhuǎn)錄速度下降;如果5-甲基胞嘧啶脫氨基形成胸腺嘧啶(T)時(shí),則這種阻斷作用消失,因而轉(zhuǎn)錄速度將加快;③內(nèi)含子是高等真核生物基因中主要的非編碼元件,以往曾被認(rèn)為無(wú)重要的功能,但近年來(lái)研究表明,它在RNA剪切過(guò)程中可能有重要的作用。RNA剪切過(guò)程就是精確去除內(nèi)含子,而內(nèi)含子堿基發(fā)生位點(diǎn)突變后,可能造成內(nèi)含子剪切異常,并可能導(dǎo)致基因重組、外顯子重復(fù)或者外顯子再現(xiàn)而提高了特異功能結(jié)構(gòu)域的劑量,這樣可能提高蛋白質(zhì)的活性或使翻譯后剪切產(chǎn)生多個(gè)功能單位而引起劑量效應(yīng)[8]。當(dāng)然IL-13 Intron3+1923位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)轉(zhuǎn)錄及翻譯水平影響的確切機(jī)制尚未完全明了,這有待國(guó)內(nèi)外專家在基因分子水平上做更深入的研究。

    表 1 IL-13+1923位點(diǎn)哮喘組與對(duì)照組等位基因頻率分布

    表 2 IL-13+1923位點(diǎn)哮喘組與對(duì)照組不同基因型血漿IL-13及總IgE水平(x±s)

    目前認(rèn)為哮喘是一種多基因遺傳病,同時(shí)受遺傳因素和環(huán)境因素的雙重影響。因此,對(duì)哮喘的治療,至今還沒(méi)有一種很好的方法。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展,對(duì)哮喘基因的研究使人們能在基因水平上對(duì)哮喘進(jìn)行治療。應(yīng)用抗IL-13抗體,以阻斷IL-13的作用,或通過(guò)蛋白酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)IL-13的合成,以及應(yīng)用反義寡核苷酸抑制受體的表達(dá)也將可能成為特異性治療哮喘的新的途徑。

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