火龍果果皮色素的提取及其抗氧化活性的研究

王標(biāo)詩(shī)，王文青，麥潔明，江 敏，金 蓓，杜建中，李汴生

(1.湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048;2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

火龍果，本名青龍果、紅龍果。火龍果樹(shù)為仙人掌科的三角柱屬植物，原產(chǎn)于巴西、墨西哥等中美洲熱帶沙漠地區(qū)，屬典型的熱帶植物?；瘕埞且环N由南洋引入臺(tái)灣，再由臺(tái)灣改良引進(jìn)海南省及大陸南部廣西、廣東等地栽培的植物?；瘕埞蚱渫獗砣赓|(zhì)鱗片似蛟龍外鱗而得名［1－3］。火龍果營(yíng)養(yǎng)豐富、功能獨(dú)特，它含有一般植物少有的植物性白蛋白及花青素，豐富的維生素和水溶性膳食纖維?；瘕埞钠贩N按其果皮果肉的顏色分為紅皮白肉、紅皮紅肉、黃皮白肉等 3 種［4－5］，其所含的植物性白蛋白，具粘性，膠質(zhì)性，對(duì)重金屬中毒者有解毒功效，對(duì)胃壁有保護(hù)作用。果皮中的花青素具有抗氧化、抗自由基、延緩衰老作用，能預(yù)防腦細(xì)胞變性，抑制老年性癡呆的發(fā)生;含可溶性膳食纖維，能降血糖，預(yù)防大腸癌等等［5－6］?；瘕埞麑?shí)富含大量的天然色素，從皮到肉的顏色呈玫瑰紅到紫紅色，是天然色素提取加工的良好來(lái)源［7］。目前火龍果的開(kāi)發(fā)項(xiàng)目主要有酵素產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、天然食用色素開(kāi)發(fā)、烈性果酒制作、種子油提?。?］、凝膠汁美容護(hù)膚、化妝產(chǎn)品研制［9］和果膠［10］等，但對(duì)火龍果果皮的利用開(kāi)發(fā)鮮有報(bào)道?；瘕埞な腔瘕埞芳庸さ母碑a(chǎn)物。利用食用和加工中丟棄的果皮提取色素，不但可以化廢為寶，且可以大大提高火龍果的綜合利用開(kāi)發(fā)價(jià)值。因此，研究火龍果皮色素及其功能性質(zhì)有著深遠(yuǎn)的意義。可以實(shí)現(xiàn)對(duì)菠蘿皮渣的高值化綜合利用，不僅有利于解決環(huán)境問(wèn)題，還將帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。目前，有關(guān)火龍果果皮色素的研究?jī)H限于不同種類的火龍果果皮色素的提取純化及穩(wěn)定性等方面［11－12］，而有關(guān)火龍果果皮色素抗氧化活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以火龍果果皮為對(duì)象，利用有機(jī)溶劑提取色素，優(yōu)化提取工藝條件，并研究其抗氧化活性。此研究的開(kāi)展可以充分利用火龍果資源，為火龍果的深加工和副產(chǎn)物利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白色果肉火龍果果皮 購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng);無(wú)水乙醇 廣東光華化學(xué)廠有限公司;1，1－二苯－2－苦肼基(DPPH) 上海品純?cè)噭┯邢薰?鄰二氮菲、磷酸氫二鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠;磷酸二氫鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;30%過(guò)氧化氫 廣東汕頭市西隴化工廠;硫酸亞鐵 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;三羥甲基氨基甲烷 上海一帆試劑有限公司;焦性沒(méi)食子酸 浙江省溫州市東升化工試劑廠;氯化鈉 天津市大茂有限公司;氯化鉀 天津市大茂集團(tuán)有限公司;以上及其他化學(xué)試劑均為分析純。

HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;PHS－3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DHG－9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、V－1100D可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FA2104N型電子精密分析天平 上海濟(jì)成分析儀器有限公司;HH－數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;80－2電動(dòng)離心機(jī) 金壇市新航儀器廠;KYC－100C空氣恒溫?fù)u床 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;C型玻璃儀器氣流烘干器 長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;JYL－350A九陽(yáng)料理機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 火龍果果皮色素的提取工藝研究

1.2.1.1 原料預(yù)處理 將當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上新鮮的火龍果果皮取出，去除附在上面的綠色部分的果皮。將紅色部分的果皮剪成3～4cm2大小的小塊，于烘箱中60℃烘12h，冷卻到室溫，用料理機(jī)粉碎成粉末貯于干燥帶塞的玻璃瓶，置于干燥陰涼的地方待用。

1.2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)方法 稱取一定量烘干的粉末狀火龍果果皮若干份，分別在不同的料液比、提取時(shí)間、提取溫度等條件下進(jìn)行單因素平行實(shí)驗(yàn)，各反應(yīng)液分別以相應(yīng)的DPPH·清除率為指標(biāo)，得出適宜的條件。

稱取 1g火龍果皮粉，分別加入 11、12、13、14、15mL 90%乙醇提取色素液，25℃恒溫水浴并振蕩(150r/min)2h后離心過(guò)濾。并測(cè)定各提取液對(duì)DPPH·的清除率，確定最適的料液比。

稱取1g火龍果皮于6支帶塞大試管中，加入等量的90%的乙醇，室溫下提取色素，每隔30min測(cè)定各提取液對(duì)DPPH·的清除率，確定最適提取時(shí)間。

稱取等量火龍果皮粉，按一定的料液比，分別置于25、30、35、40℃四個(gè)不同溫度下恒溫水浴鍋中振蕩(150r/min)，提取2h后離心，測(cè)定各提取液對(duì)DPPH·的清除率，確定最適的提取溫度。

1.2.1.3 正交實(shí)驗(yàn)方法 采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，應(yīng)用L9(34)正交表，對(duì)料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表1)，以提取液對(duì)DPPH的清除率為指標(biāo)，得出提取火龍果果皮色素的最佳條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.2 火龍果果皮色素的抗氧化性研究

1.2.2.1 火龍果果皮色素提取液對(duì)DPPH·的清除作用 參考文獻(xiàn)［13－14］。取0.0002mg/mL的 DPPH·溶液(用無(wú)水乙醇配制)2mL，加入不同濃度的提取液2mL，室溫反應(yīng)30min，測(cè)定其在517nm處的吸光度值，空白組以2mL無(wú)水乙醇代替試樣，并按式(1)計(jì)算清除率:

1.2.2.2 火龍果果皮色素提取液對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用 參考文獻(xiàn)［15－16］。取pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液2.0mL，依次加入7.5mmol/mL鄰二氮菲2.0mL，7.5mmol/mL硫酸亞鐵溶液2.0mL，不同濃度的提取液1.0mL，0.01%過(guò)氧化氫1.0mL，每加一種溶液都要充分混勻。將反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴鍋中，反應(yīng)1h后離心，取上層清液，測(cè)定其在536nm處吸光度，為A1。用蒸餾水代替樣品提取液測(cè)得的吸光度為A2，用蒸餾水代替樣品提取液和過(guò)氧化氫所得的吸光度為A3，然后按式(2)計(jì)算清除率:

1.2.2.3 火龍果果皮色素提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 參考文獻(xiàn)［17－18］。取 4.5mL 0.05mol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.2)于試管中，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，加入不同濃度的火龍果皮色素提取液1mL，2.5mol/L鄰苯三酚0.4mL，混勻后在25℃水浴中反應(yīng)4min，立即用8mol/L HCl兩滴終止反應(yīng)，并在420nm處測(cè)定吸光度(用蒸餾水調(diào)零)，空白組的用1mL蒸餾水代替樣品，并按式(3)計(jì)算清除率:

以上實(shí)驗(yàn)均平行三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果果皮色素提取工藝研究

2.1.1 乙醇濃度選擇結(jié)果 不同乙醇濃度對(duì)火龍果果皮色素清除DPPH·的結(jié)果見(jiàn)圖1。在乙醇濃度為50%～90%時(shí)，火龍果果皮色素提取液對(duì)DPPH·的清除率都超過(guò)90%，而當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí)，火龍果果皮色素提取液對(duì)DPPH·的清除率反而顯著降低(p＜0.05)。由于濃度低于70%時(shí)，火龍果果皮色素提取液的粘度較高，顏色也較深，說(shuō)明提取液所含有的雜質(zhì)較多，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇90%的乙醇作為提取試劑。

圖1 乙醇濃度對(duì)火龍果果皮色素提取液DPPH·清除率的影響Fig.1 Effect of ethanol content on scavenging DPPH free radical of the pigment from pitaya peel

2.1.2 料液比的選擇結(jié)果 料液比對(duì)火龍果果皮色素清除DPPH·的結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，火龍果皮提取液對(duì)DPPH·的清除率在一定的料液比范圍內(nèi)呈逐漸增大的趨勢(shì)，在所研究的料液比范圍內(nèi)最低可達(dá)93.0%，當(dāng)料液比為1∶14(g/mL)時(shí)，又有所下降，在1∶15(g/mL)達(dá)到最佳，可達(dá) 97.2%，之后又有所下降?？赡苡捎谶_(dá)到最高清除率后再提高料液比，色素濃度被稀釋，清除率又會(huì)下降。故綜合考慮，選擇料液比為 1∶14、1∶15、1∶16(g/mL)作為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖2 料液比對(duì)火龍果果皮色素提取液DPPH·清除率的影響Fig.2 Effect of rate of material to liquid on scavenging DPPH free radical of the pigment from pitaya peel

2.1.3 提取時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 提取時(shí)間對(duì)火龍果果皮色素清除DPPH·的結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，火龍果皮色素提取液對(duì)DPPH·的清除率先降低后增加，而后趨于不變，其中在90min時(shí)達(dá)到最低為85.1%，在120、150、180min 處均高于94%，且變化不大，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，再延長(zhǎng)時(shí)間，色素提取液清除率基本上不發(fā)生變化，說(shuō)明色素基本上被提取完全。故綜合考慮，選擇提取時(shí)間為120、150、180min作為正交實(shí)驗(yàn)的三個(gè)水平。

2.1.4 提取溫度的選擇結(jié)果 提取溫度對(duì)火龍果果皮色素清除DPPH·的結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，溫度對(duì)DPPH·的清除率影響不是很大，先略有降低后增加，之后再降低，說(shuō)明火龍果色素有最適提取溫度，溫度過(guò)高可能影響色素的穩(wěn)定性。在35℃時(shí)清除率達(dá)到最高為95.6%，25和30℃時(shí)的清除率都要高于40℃時(shí)的清除率，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件的方便性選擇25、30、35℃三個(gè)提取溫度作為正交實(shí)驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖3 提取時(shí)間對(duì)火龍果果皮色素提取液DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of extracting time on scavenging DPPH free radical of the pigment from pitaya peel

圖4 提取溫度對(duì)火龍果果皮色素提取液DPPH·清除率的影響Fig.4 Effect of extracting temperature on scavenging DPPH free radical of the pigment from pitaya peel

2.1.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定影響火龍果果皮色素提取的3個(gè)因素3個(gè)水平(見(jiàn)表1)，采用L9(34)表用進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 The results of orthogonal experiment

由表2可得出，各因素對(duì)火龍果果皮色素提取液對(duì)DPPH·自由基的清除作用的影響主次順序依次為溫度＞提取時(shí)間＞料液比。最佳水平組合為A1B3C3，即采用提取溶劑為90%乙醇，提取溫度為25℃，提取時(shí)間為 180min，料液比為 1∶16(g/mL)，在此條件下對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)94.68%。

由表3方差分析可知，在火龍果果皮色素提取工藝正交實(shí)驗(yàn)所選擇的因素和水平范圍內(nèi)，A、B、C因素的影響均未達(dá)到顯著性水平(p＜0.05)，即提取溫度、時(shí)間和料液比對(duì)火龍果果皮色素的DPPH·清除作用的影響均不顯著，而F值結(jié)果表明方差分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance on the result of orthogonal experiment

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明采用提取溶劑為90%乙醇，提取溫度為35℃，提取時(shí)間為120min，料液比為1∶16的實(shí)驗(yàn)條件，提取的火龍果果皮色素對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)94.43%±0.24%。這與正交結(jié)果基本一致。

2.2 火龍果果皮色素的抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 對(duì)DPPH·的清除結(jié)果 DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，溶液在波長(zhǎng)517nm處有特征吸收峰，呈紫紅色。自由基清除劑可與其單電子配對(duì)而使其吸收減弱，減弱程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因此可用分光光度法評(píng)價(jià)火龍果皮色素提取液對(duì)自由基的清除情況。由圖5結(jié)果表明，火龍果皮色素提取液對(duì)DPPH·的清除作用比較大，結(jié)果呈對(duì)數(shù)關(guān)系，隨著火龍果皮色素提取液的濃度的增大，DPPH·的清除率越大，其關(guān)系式為y=26.071Ln(x)+30.736，相關(guān)系數(shù)R2=0.9965，火龍果果皮色素提取液清除50%DPPH·的有效濃度分別為 2.09mg/mL。當(dāng)樣品濃度為 14.29mg/mL時(shí)，DPPH·的清除率達(dá)到100%。其關(guān)系表明在很低的樣品百分比下都可以顯示出較高的清除率。

2.2.2 羥自由基的清除結(jié)果 H2O2－Fe2+體系可通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生自由基，鄰二氮菲－Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲－Fe3+后，其536nm最大吸收峰消失，建立以A536變化反映羥自由基氧化作用的比色測(cè)定法，可評(píng)價(jià)火龍果皮色素提取液對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力。由圖6可知，火龍果皮色素提取液對(duì)羥自由基的清除作用呈正相關(guān)，其關(guān)系為:y=1.7602x－31.008，相關(guān)系數(shù) R2=0.9937，火龍果果皮色素提取液清除50%·OH的有效濃度分別為46.02mg/mL左右。當(dāng)樣品濃度為74.43mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率可以達(dá)到100%，顯示了火龍果果皮色素提取液對(duì)羥自由基有很大的清除作用。

圖5 火龍果果皮色素對(duì)DPPH自由基(DPPH·)清除能力Fig.5 DPPH free radical(DPPH·)scavenging capacity of the pigment from pitaya peel

2.2.3 對(duì)超氧陰離子自由基的清除結(jié)果 超氧自由基是機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)火龍果皮色素對(duì)超氧陰離子自由基生成均具有一定的清除作用。其清除作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7，由圖7可知，火龍果果皮的色素提取液對(duì)超氧陰離子的清除作用呈正相關(guān)，在低百分比的濃度范圍內(nèi)的關(guān)系為 y=20.481x+0.034，火龍果果皮色素提取液清除50%·的有效濃度分別為2.44mg/mL，在色素提取液濃度4.88mg/mL左右就可百分百清除超氧陰離子，顯示出了火龍果皮的色素提取液的超強(qiáng)的清除超氧陰離子的能力。

圖7 火龍果果皮色素對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.7 Superoxide anion radical scavenging capacity of the pigment from pitaya peel

由以上抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，火龍果果皮色素具有一定的抗氧化活性，但在不同的體系當(dāng)中，其活性大小有所差別。由于實(shí)驗(yàn)室條件有限，本實(shí)驗(yàn)得到的火龍果果皮色素屬粗色素，如果要準(zhǔn)備評(píng)價(jià)其中的具體色素的抗氧化性能，還需要進(jìn)一步的分離純化。目前研究表明，色素具有一定的抗氧化活性［14］。本實(shí)驗(yàn)得到的醇溶性粗色素可能包括花青素等多酚類色素和其他黃酮類色素。

3 結(jié)論

3.1 采用有機(jī)溶劑乙醇提取法提取火龍果果皮色素，利用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，最佳工藝參數(shù):提取溶劑為90%乙醇，提取溫度為25℃，提取時(shí)間為180min，料液比為1∶16(g/mL)，在此條件下對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)94.68%。

3.2 采用體外模型從羥自由基(·OH)的清除能力，DPPH自由基(DPPH·)的清除能力和超氧陰離子清除能力三個(gè)角度評(píng)價(jià)其抗氧化活性。研究結(jié)果表明，火龍果果皮色素清除50%DPPH·、·OH與·的有效濃度分別為2.09、46.0、2.44mg/mL?；瘕埞ど靥崛∫簩?duì)DPPH自由基的清除作用在一定的范圍內(nèi)呈對(duì)數(shù)遞增;對(duì)超氧自由基的清除作用和羥基自由基的清除作用與其濃度呈正相關(guān)。

［1］許偉東，廖劍鍬，劉加健，等.火龍果引種初報(bào)［J］.中國(guó)南方果樹(shù)，2002，31(1):337－341.

［2］韓鵬.吉祥之果——火龍果［J］.中國(guó)食品，2011(12):82－83.

［3］李德勇.栽培火龍果市場(chǎng)前景廣闊［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，2001(8):381.

［4］鄧仁菊，范建新，蔡永強(qiáng).國(guó)內(nèi)外火龍果研究進(jìn)展及產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(6):188－192.

［5］張福平，林小瓊.火龍果果皮多酚氧化酶特性的研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(7):57－59.

［6］余慧琳，王愛(ài)武.火龍果保健價(jià)值及離體快繁關(guān)鍵技術(shù)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(8):102－104.

［7］叢燕.利用火龍果果皮資源開(kāi)發(fā)食用天然色素［J］.廈門(mén)科技，2009(1):56－57.

［8］陳廣超，謝曉明，林燕絨.火龍果組培快繁技術(shù)［J］.中國(guó)南方果樹(shù)，2003，32(3):31.

［9］董銀卯，何聰，芬王領(lǐng)，等.火龍果酵素生物活性的初步研究［J］.食品科技，2009，34(3):192－196.

［10］楊明，胡文娥，吳壽中.微波輔助提取火龍果果皮中果膠工藝［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33(2):55－57.

［11］張倩茹，袁唯.火龍果果皮色素提取及其穩(wěn)定性研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2011(9):63－64.

［12］莊明珠，劉青茹，李婉霞，等.多酚類物質(zhì)和金屬離子對(duì)火龍果果皮色素穩(wěn)定性的影響［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27(11):1320－1324.

［13］王威.黃酮類食用天然色素抗氧化活性的研究［J］.食品科學(xué)，2001，22(5):26－28.

［14］Biao－ Shi Wang，Bian－ Sheng Li，Qing－ Xiao Zeng，et al.Antioxidant and free radical scavenging activities of pigments extracted from molasses alcohol wastewater［J］.Food Chemistry，2008，107:1198－1204.

［15］Siddhuraju P，Becker K.The antioxidant and free radical scavenging activities of processed cowpea(Vigna unguiculata(L.)Walp.)seed extracts［J］.Food Chemistry，2007，101:10－19.

［16］張繼，孔潔，張芳.植物油清除自由基能力研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(9):3521－3523.

［17］王秋霞，許琳，楊永紅.石榴籽丙酮提取物抗氧化活性研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，127(8):174－176.

［18］ Zhao YP，Yu WL，Wang DP.Chemiluminescence determination offree radicalscavenging abilities of‘tea pigments’and comparison with ‘tea polyphenols’［J］.Food Chemistry，2003，80:115－118.