用于殼聚糖降解的復(fù)合酶制劑產(chǎn)生菌的篩選

閻賀靜，胡志平，韓曉紅，段春紅，王海波，李 佳，梅雙喜

(武漢生物工程學(xué)院生物工程系，湖北武漢 430415)

殼聚糖在自然界中儲(chǔ)量豐富，可再生和可生物降解，由于具有獨(dú)特的生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、紡織及農(nóng)林牧等領(lǐng)域。但高分子量的殼聚糖水溶性差，溶于弱酸性介質(zhì)，粘度高，不易吸收，因此殼聚糖的應(yīng)用開(kāi)發(fā)受到限制。低分子量殼聚糖具有許多高分子殼聚糖無(wú)法相比的生理功能和活性，不僅利于人體吸收，還具有抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、抵抗微生物感染、促進(jìn)止血以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗毒素等諸多生理活性［1－6］。這些優(yōu)點(diǎn)使殼低聚糖在食品、生物醫(yī)藥、日用化妝品、農(nóng)業(yè)等方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。目前殼低聚糖的生產(chǎn)方法主要由殼聚糖降解獲得，其中以化學(xué)法和酶解法為主。酶解法是利用專(zhuān)一性酶或非專(zhuān)一性酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解的方法。因反應(yīng)條件溫和而被認(rèn)為極具工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值。因此，殼聚糖的酶法降解成為目前的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究者不斷提出采用不同的酶及酶解方法制備高活性的殼寡糖［7－10］。其中，殼聚糖酶(EC.3.2.1.132)被認(rèn)為是制備殼寡糖最理想的酶制劑，其作用專(zhuān)一，適當(dāng)控制反應(yīng)條件即能獲得理想分子量的殼寡糖。但由于專(zhuān)一性酶較難獲得，成本過(guò)高，難以實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。因此，尋找非專(zhuān)一酶來(lái)對(duì)殼聚糖進(jìn)行水解就顯得尤為重要。目前已發(fā)現(xiàn)40多種非專(zhuān)一性酶對(duì)殼聚糖具有水解活性。其中，效果較為顯著的酶有纖維素酶、果膠酶、脂肪酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶等［11－15］。還有研究者發(fā)現(xiàn)，采用幾種酶例如纖維素酶、α－淀粉酶、蛋白酶等共同作用于殼聚糖，其水解作用比單一酶強(qiáng)［16］。在適當(dāng)條件下，用這些酶水解殼聚糖可以得到相對(duì)分子質(zhì)量1000～4000的低聚糖［17］。這些非專(zhuān)一性酶來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜，成為低聚殼聚糖工業(yè)化生產(chǎn)的理想選擇。但復(fù)合酶的特性及其協(xié)同作用的發(fā)揮受單一酶的來(lái)源及批次的影響很大，最終產(chǎn)品特性隨之波動(dòng)較大，同時(shí)也不利于殼聚糖水解條件的控制。因此，制備性質(zhì)穩(wěn)定的復(fù)合酶制劑有利于生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品質(zhì)量的控制。微生物在固態(tài)培養(yǎng)條件下酶系較全，生產(chǎn)力高，且許多情況下固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)真菌酶的溫度和pH穩(wěn)定性較高［18－19］。本文利用殼聚糖作為唯一碳源，在固態(tài)發(fā)酵條件下篩選生產(chǎn)多種殼聚糖降解酶的菌種，并考察了該菌所產(chǎn)復(fù)合酶中殼聚糖酶、纖維素酶、α－淀粉酶等酶的酶活，同時(shí)確定了該復(fù)合酶降解殼聚糖的基本條件，并利用有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀對(duì)殼聚糖降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定了該菌產(chǎn)復(fù)合酶在低聚殼聚糖制備方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 采自武漢生物工程學(xué)院池塘邊、菜地、樹(shù)林等處;D(+)－Galacturonic acid(半乳糖醛酸) 購(gòu)于sigma公司;其他試劑 均為分析純;玉米和豆粕 購(gòu)于武漢千禾糧貿(mào)有限公司;富集培養(yǎng)基1%(NH4)2SO4，0.07%K2HPO4，0.03%KH2PO4，0.5%NaCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.1% 葡萄糖，1%膠體殼聚糖，調(diào)pH至6.0，殼聚糖單獨(dú)滅菌(115℃，20min);初篩培養(yǎng)基 1%膠體殼聚糖，0.5%(NH4)2SO4，0.2%K2HPO4，0.5%NaCl，0.1%MgSO4·7H2O，2.0%瓊脂，調(diào) pH 至 6.5～7.5，滅菌條件:121℃，20min，殼聚糖膠體液?jiǎn)为?dú)滅菌(115℃，20min);復(fù)篩培養(yǎng)基 玉米粉∶豆粕 =3∶5;殼聚糖4%;母液(g/L):MgSO40.5，KH2PO40.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，ZnSO40.1;(NH4)2SO40.5%;含水量(母液加入量)7mL，121℃滅菌30min。

AB104－N型電子分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;DJ1C增力電動(dòng)攪拌器 江蘇省金壇市大地自動(dòng)化儀器廠;722S可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海市棱光技術(shù)有限公司;DK－8D數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SPX－150B－Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HQ45Z恒溫?fù)u床 武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司;凈化工作臺(tái) 濟(jì)南康寶凈化設(shè)備有限責(zé)任公司;80－2B離心機(jī) 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)殼聚糖酶菌種的篩選

1.2.1.1 富集培養(yǎng) 取10g土樣置于加有90mL無(wú)菌生理鹽水浸泡1h，溫室振蕩30min，將樣品充分打散。靜置后吸1.0mL懸液于液體培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)48h。

1.2.1.2 初篩 將富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋后，均勻涂布于以殼聚糖為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基中。于30℃培養(yǎng)3d。選擇平板中菌落周?chē)该魅χ睆脚c菌落直徑比值較大的菌落進(jìn)行第二次平板篩選。

將第一次初篩菌種，點(diǎn)接至初篩平板中，每個(gè)平板接種4個(gè)點(diǎn)，于30℃中培養(yǎng)3d后，選擇透明圈直徑與菌落直徑比值較大者進(jìn)行斜面保藏用于復(fù)篩。

1.2.1.3 復(fù)篩 將初篩菌種孢子制備成孢子懸液，接入到復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)5d。用醋酸緩沖液浸提酶曲4h，過(guò)濾得粗酶液，測(cè)定粗酶液中殼聚糖酶酶活。

1.2.1.4 復(fù)篩菌種初步鑒定 將復(fù)篩菌種接種至初篩平板中，30℃培養(yǎng)3d，每天觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行記錄。挑取培養(yǎng)3d的菌絲和孢子進(jìn)行乳酸石碳酸棉蘭染色，顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)并記錄。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征，參照真菌鑒定手冊(cè)對(duì)該菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 復(fù)合酶產(chǎn)生菌各種酶酶活測(cè)定 將篩選獲得的菌株接入到復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基中，一定條件培養(yǎng)3d后，用醋酸緩沖液浸提酶曲4h，過(guò)濾得粗酶液，測(cè)定粗酶液中殼聚糖酶、纖維素酶酶活、α－淀粉酶、果膠酶、蛋白酶、木聚糖酶和脂肪酶的酶活。

1.2.3 復(fù)合酶對(duì)殼聚糖的降解作用

1.2.3.1 復(fù)合酶降解殼聚糖的溫度 將殼聚糖溶于1%的pH5.0 NaAc－HAc溶液中，配成1%殼聚糖溶液，在不同溫度(40、45、50、55、60℃)下進(jìn)行酶解，反應(yīng)時(shí)間60min，測(cè)定酶解液中還原糖的量。

1.2.3.2 復(fù)合酶降解殼聚糖的pH 分別以NaAc－HAc緩沖溶液配制濃度均為1%的pH為3.8、4.4、5.0、5.6、6.2的殼聚糖溶液，在50℃進(jìn)行酶解，反應(yīng)時(shí)間60min，酶解完成后測(cè)定酶解液中還原糖的量。

1.2.3.3 復(fù)合酶降解殼聚糖時(shí)間的確定 將殼聚糖溶于1%的pH5.0 NaAc－HAc溶液中，配成1%殼聚糖溶液，在50℃進(jìn)行酶解，測(cè)定不同酶解時(shí)間(1、2、3、4、5h)酶解液中的還原糖的量。

1.2.4 復(fù)合酶降解殼聚糖終產(chǎn)物的分級(jí)沉淀 采用甲醇－丙酮分級(jí)沉淀法［20］。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 酶活測(cè)定 殼聚糖酶酶活根據(jù)Yasushi報(bào)道的方法測(cè)定［21］;纖維素酶酶活根據(jù)Bailey報(bào)道的方法測(cè)定［22］;α－淀粉酶酶活測(cè)定在 Fisher等所報(bào)道方法進(jìn)行［23］;果膠酶酶活根據(jù)Brühlmann報(bào)道的方法測(cè)定［24］;木聚糖酶酶活根據(jù) Bailey 的方法測(cè)定［25］;蛋白酶酶活采用Foline試劑顯色法測(cè)定［26］;脂肪酶酶活根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法測(cè)定［27］。

1.3.2 還原糖的測(cè)定 用DNS顯色法測(cè)定酶解液中還原糖的量。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 根據(jù)Bradford法測(cè)定［28］。

以上實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)酶菌株的初篩

殼聚糖不溶于水，以殼聚糖為唯一碳源的平板培養(yǎng)基為非透明狀，殼聚糖水解后會(huì)使培養(yǎng)基變透明，由此初步判定該菌產(chǎn)的酶能夠降解殼聚糖。從采集的10種土壤樣品中，篩選到6株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株。其菌落周?chē)该魅χ睆脚c菌落直徑的比值(D/d)介于0.6～0.9，C－1、C－2 和 C－3 菌株的透明圈較大，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)酶菌株初篩結(jié)果Table1 Primary screening results for enzyme production strain

2.2 產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩

在固態(tài)培養(yǎng)基中，微生物產(chǎn)酶量高且酶種類(lèi)豐富。為了篩選出殼聚糖降解復(fù)合酶產(chǎn)生菌，將初篩菌株中透明圈較大者C－1、C－2和C－3接入固態(tài)復(fù)篩培養(yǎng)基中，發(fā)酵后測(cè)粗酶液中殼聚糖酶酶活，結(jié)果如表2所示。

表2 固態(tài)培養(yǎng)復(fù)篩結(jié)果Table2 Secondary screening results based on solid state fermentation

由表2可見(jiàn)，C－3菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活較高，所以選擇C－3作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。

2.3 產(chǎn)酶菌株的形態(tài)鑒定

C－3菌株在初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，其菌落形態(tài)特征如圖1所示。

圖1 菌落形態(tài)特征Fig.1 Colonial morphology of C－3 strain on solid medium

由圖1可見(jiàn)，菌株C－3菌落較大，白色，邊緣呈絨毛狀和絮狀，質(zhì)地疏松，外觀干燥，不透明，菌絲白色，產(chǎn)綠色孢子，后期呈黑褐色，菌落與培養(yǎng)基間連接緊密，不易被挑取。

進(jìn)一步對(duì)C－3菌株進(jìn)行乳酸石碳酸棉蘭染色，結(jié)果見(jiàn)圖2。在顯微鏡下可見(jiàn)分生孢子頭，頂囊呈綠色燒瓶狀，小梗單層，排列成木柵狀，布滿(mǎn)頂囊表面。頂端有鏈形排列的球狀分生孢子，壁表面光滑，在營(yíng)養(yǎng)菌絲內(nèi)可見(jiàn)到明顯的隔。參照真菌鑒定手冊(cè)初步判定該菌株為曲霉屬。

圖2 C－3菌株顯微鏡檢結(jié)果Fig.2 C－3 microscope examination results

2.4 C－3產(chǎn)復(fù)合酶中各種酶酶活

一般情況下，微生物在固態(tài)培養(yǎng)基中的酶系比較豐富。測(cè)定C－3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)復(fù)合酶中蛋白質(zhì)的含量和各種酶的酶活，有利于考察該復(fù)合酶的主要酶組分和其含量。C－3復(fù)合酶酶液中各酶活及比活力結(jié)果如表3所示。

由表3可見(jiàn)，菌株C－3固態(tài)發(fā)酵酶液中含有多種酶。其中，α－淀粉酶酶活最大為3.229U/mL，殼聚糖酶和纖維素酶的酶活分別為2.206、0.790U/mL。值得注意的是，表3中殼聚糖的水解活性并不是指殼聚糖酶酶活，而是復(fù)合酶對(duì)殼聚糖降解作用的綜合酶活。是復(fù)合酶中纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等降解殼聚糖的協(xié)同作用的表現(xiàn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，纖維素酶來(lái)源廣泛，且對(duì)殼聚糖具有較好的水解作用［11］;同時(shí) Pan Sai－kun［14］的報(bào)道表明，α－淀粉酶對(duì)殼聚糖也有一定的降解作用;其次，果膠酶、脂肪酶及蛋白酶對(duì)殼聚糖的降解作用也有報(bào)道［12－13］。另外，有研究表明，將纖維素酶、α－淀粉酶、蛋白酶等共同用于殼聚糖的降解，其作用優(yōu)于單一酶［16］。由此可見(jiàn)，C－3產(chǎn)復(fù)合酶中的主要酶制劑均是對(duì)殼聚糖有較好降解作用的非專(zhuān)一性酶。由此可以初步推斷，C－3復(fù)合酶應(yīng)對(duì)殼聚糖有一定的降解作用。

表3 C－3固態(tài)發(fā)酵酶液中不同酶的酶活及比活力Table3 Different enzymes activity and its specific activity in C－3 solid state fermentation enzyme preparation

2.5 C－3復(fù)合酶降解殼聚糖的作用條件

2.5.1 復(fù)合酶降解殼聚糖的溫度 由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，隨溫度的升高還原糖的量迅速增加，50℃時(shí)達(dá)到最高。之后隨溫度的升高，還原糖的量顯著降低。表明，該復(fù)合酶降解殼聚糖的最適溫度為50℃。

圖3 溫度對(duì)C－3復(fù)合酶降解殼聚糖的影響Fig.3 Effect of temperature on chitosan degradation for C－3 complex enzymes

2.5.2 復(fù)合酶降解殼聚糖的pH 由圖4可見(jiàn)，反應(yīng)pH由3.8增至5.6時(shí)，還原糖的量明顯增加;在pH5.6～6.2范圍內(nèi)，反應(yīng)體系產(chǎn)還原糖的量變化不大。說(shuō)明此復(fù)合酶在pH5.6到pH6.2范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。由于殼聚糖溶于微酸環(huán)境，繼續(xù)增加反應(yīng)pH將無(wú)法保證酶促反應(yīng)的順利進(jìn)行。因此，確定C－3復(fù)合酶降解殼聚糖的適宜pH為5.6～6.2。

2.5.3 復(fù)合酶降解殼聚糖的酶解時(shí)間 對(duì)C－3復(fù)合酶降解殼聚糖的酶解時(shí)間的考察發(fā)現(xiàn)，在酶解初期還原糖釋放量迅速增加，但酶解時(shí)間達(dá)到4h后，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，反應(yīng)體系中還原糖的量增加趨緩。這可能是由于酶的失活或底物的減少及產(chǎn)物的增加所造成的。因此，酶解時(shí)間以4h為宜。

圖4 pH對(duì)C－3復(fù)合酶降解殼聚糖的影響Fig.4 Effect of pH on chitosan degradation for C－3 complex enzymes

圖5 C－3復(fù)合酶酶解時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響Fig.5 Effect of inculbation time on chitosan degradation for C－3 complex enzymes

2.5.4 復(fù)合酶降解殼聚糖終產(chǎn)物分析 分子量對(duì)殼聚糖的性質(zhì)有很大影響，不同分子量的殼聚糖性質(zhì)差異很大，殼聚糖的許多獨(dú)特功能只有在分子量降低到一定程度時(shí)才表現(xiàn)出來(lái)。殼聚糖酶解產(chǎn)物是判斷C－3復(fù)合酶是否具有應(yīng)用價(jià)值的依據(jù)之一。據(jù)Muraki報(bào)道，DP＞16的低聚殼聚糖不溶于50%的甲醇溶液，8＜DP＜16的低聚殼聚糖溶于50%甲醇溶液而不溶于90%甲醇溶液，同時(shí)DP＜8的低聚殼聚糖溶于90%甲醇溶液而不溶于90%丙酮溶液［20］。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇－丙酮分級(jí)沉淀可以考察酶解產(chǎn)物中各種低聚殼聚糖的含量，結(jié)果如表4所示。

表4 C－3復(fù)合酶降解殼聚糖產(chǎn)物的含量Table4 Components of the products from chitosan degradation with C－3 complex enzymes

使用的殼聚糖原材料的聚合度(DP)約為500，由表4可知，殼聚糖經(jīng)C－3復(fù)合酶降解后，8＜DP＜16和DP＜8的產(chǎn)物量分別占總產(chǎn)物的27.9%和41.16%。許多研究表明，聚合度為2～10的殼聚糖具有許多獨(dú)特的新功能，特別是聚合度6～8的殼寡糖具有高活性的抗腫瘤作用［29］。聚合度3～7的殼寡糖可以增加鈣的吸收，從而降低糞便鈣的排泄［30］。另外，有研究認(rèn)為，分子量1500左右的殼寡糖抗菌活性大大高于高分子量的殼聚糖［31］。由此可推斷，C－3復(fù)合酶在低聚殼聚糖生產(chǎn)方面具有一定的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

從土壤中篩選出一株降解殼聚糖的復(fù)合酶產(chǎn)生菌C－3，該菌株初步鑒定為曲霉菌。C－3復(fù)合酶中以殼聚糖酶、纖維素酶、α－淀粉酶為主，它們的酶活分別為2.206、0.790、3.229U/mL。該復(fù)合酶降解殼聚糖的條件為溫度50℃，pH5.6，酶解時(shí)間為4h。該復(fù)合酶降解殼聚糖的酶解產(chǎn)物中以DP＜16的殼寡糖為主，表明該復(fù)合酶在殼寡糖制備方面具有一定應(yīng)用潛力。

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