鮭魚皮明膠水解物的抗氧化活性及其對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

付 余，趙新淮

(乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030)

自由基和活性氧可以攻擊生物體內(nèi)的糖蛋白、核酸和脂質(zhì)，從而加速衰老并誘發(fā)癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化等一系列退行性疾?。?］。尋找天然抗氧化劑預(yù)防機(jī)體氧化損傷，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。大量的水解物和肽類被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化性質(zhì)，這些抗氧化肽源自植物或動(dòng)物蛋白，包括米糠［2］，酪蛋白［3］，蛋黃蛋白［4］，魚肉蛋白［5］。明膠作為膠原的衍生產(chǎn)物，是從動(dòng)物的結(jié)締組織或表皮組織中的膠原經(jīng)變性轉(zhuǎn)化，再經(jīng)適當(dāng)溫度提取出來的水溶性物質(zhì)，它的主要結(jié)構(gòu)與膠原相近［6］。明膠水解物是通過明膠的限制酶水解而得到的，大量研究已證實(shí)其具有良好的抗氧化活性［7－11］。然而，由于瘋牛病、口蹄疫等動(dòng)物疾病以及宗教禁忌等原因，人們對(duì)陸上動(dòng)物明膠產(chǎn)品的安全性產(chǎn)生憂慮［12］。因此，尋找明膠的新來源成為一個(gè)迫切的課題。本研究利用具有黑龍江特色的鮭魚(俗稱大麻哈魚)魚皮明膠，經(jīng)蛋白酶水解后獲得具有抗氧化活性的明膠水解物，并研究其對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BRL大鼠肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)的影響，從而為鮭魚明膠的開發(fā)利用、明膠水解物抗氧化作用機(jī)制揭示提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮭魚(Oncorhynchus keta)魚皮明膠 金箭明膠有限公司;堿性蛋白酶Alcalase(118kU/mL)、中性蛋白酶(54kU/mL)、木瓜蛋白酶(28kU/g) 購自諾維信公司和國藥化學(xué)試劑公司;鄰苯二甲醛 中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;鄰二氮菲、鄰苯三酚 天津科密歐化學(xué)試劑公司;Triton X－100、噻唑藍(lán)(MTT)北京索萊寶科技有限公司;1，1－二苯基－2－苦基苯肼(DPPH)、4－L－羥脯氨酸和DMEM培養(yǎng)基 Sigma公司;BRL大鼠肝細(xì)胞 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。LDH、MDA、GSH試劑盒 碧云天生物工程研究所;其他所有試劑 均為分析純;水 雙蒸水或超純水。

UV－2401PC紫外可見分光光度計(jì) 島津公司;HF－90 CO2培養(yǎng)箱 力康公司;VD－1320潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器公司;Model 680酶標(biāo)儀 Bio－Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮭魚皮明膠基本成分測定 蛋白質(zhì)，水分，脂肪和灰分測定分別參考GB 50010.3－2011《食品中水分的測定》，GB50010.4－2011《食品中灰分的測定》，GB 50010.5－2011《食品中蛋白質(zhì)的測定》和GB50010.7－2011《食品中脂肪的測定》。4－羥脯氨酸含量測定根據(jù)Edwards(1980)方法［13］，略有修改。

1.2.2 明膠水解物的制備 配制濃度為5%(w/w)的明膠溶液。每種蛋白酶的最適條件如下:堿性蛋白酶(pH8.5，55℃)，添加量為 1(水解時(shí)間 1、7h)和10kU/g(水解時(shí)間7h)。木瓜蛋白酶(pH6.0，60℃)，添加量為0.5(水解時(shí)間1h)和1kU/g(水解時(shí)間2、7h)。中性蛋白酶(pH7.0，45℃)，添加量為10kU/g(水解時(shí)間7h)。反應(yīng)結(jié)束后，迅速置于沸水浴15min。冷卻至室溫后，5000r/min離心20min，取上清液，真空冷凍干燥后于－20℃保存［7－11］。

1.2.3 明膠水解物的水解度(DH)測定

1.2.3.1 蛋白質(zhì)含量測定 凱氏定氮法［14］。

1.2.3.2 游離氨基含量測定 鄰苯二甲醛(OPA) 法［15］。

取3mL水解物溶液與同體積OPA試劑混合并開始計(jì)時(shí)，5min后在分光光度計(jì)上測定340nm下吸光值。計(jì)算公式如下:

DH(%)=［水解物游離氨基含量(μmol/mL)/(5.55×水解物氮含量(mg/mL)－0.39(mmol/g)］÷11.1(mmol/g)×100

其中，0.39mmol/g為測定出的明膠的游離氨基含量;11.1mmol/g為明膠的肽鍵含量;5.55為明膠氮含量換算系數(shù)。

1.2.4 抗氧化活性分析

1.2.4.1 DPPH自由基的清除活性 參考Nsimba等方法［16］。配制20μmol/L DPPH 乙醇溶液，存于暗處待用。1mL DPPH溶液與2mL的樣品溶液混合，置于暗處，室溫反應(yīng)30min，517nm處測定吸光值。以無水乙醇作為空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)平行三次。計(jì)算公式如下:

其中，A0為空白樣吸光值;A1為樣品吸光值。

1.2.4.2 羥自由基清除活性 參考 Li等方法［17］。2mL溶于0.15mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液的鄰二氮菲(0.75mmol/L)與2mL溶于0.15mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液的 FeSO4(0.75mmol/L)充分混合，加入1mL樣品和1mL 0.01%的 H2O2?；旌衔镌?7℃反應(yīng)60min，536nm下測定吸光值。計(jì)算公式如下:

其中，AS，樣品吸光值;A1，鄰二氮菲，F(xiàn)eSO4和H2O2的對(duì)照溶液的吸光值;A0，鄰二氮菲和FeSO4的空白溶液的吸光值。

1.2.4.3 超氧陰離子清除活性 采用鄰苯三酚自氧化方法［18］。1.0mL 樣品與 1.8mL 50mmol/L Tris－HCl(pH8.2)緩沖液混合。25℃下反應(yīng) 10min，加入0.1mL 10mmol/L的鄰苯三酚。320nm處測定吸光值，每0.5min讀一次數(shù)，讀數(shù)4min。樣品的鄰苯三酚氧化速率由吸收率曲線的斜率(ΔA1)計(jì)算。空白鄰苯三酚自氧化速率通過雙蒸水代替樣品(ΔA0)來測定。計(jì)算公式如下:

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) BRL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(37℃，5%CO2)培養(yǎng)，細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度種于96孔板(每孔200μL)、1×105個(gè)細(xì)胞/mL密度種于24孔板(每孔500μL)，細(xì)胞貼壁后待用。

1.2.7 明膠水解物對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(MTT法) 待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度(0.5、1、2mg/mL)不同水解度的鮭魚魚皮明膠水解物。作用24h后，加入 H2O2誘導(dǎo)損傷，條件為5mmol/L，1.5h。結(jié)束后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，每孔加入200μL DMSO，振蕩混勻，酶標(biāo)儀上檢測光密度(OD)值，波長490nm［19］。加入明膠水解物組為處理組，未加入明膠水解物和H2O2組為陰性對(duì)照組，僅加入H2O2組為損傷模型組。計(jì)算公式為:

1.2.6 明膠水解物對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞內(nèi)LDH、MDA和GSH的含量影響 使用碧云天生物工程研究所LDH、MDA、GSH試劑盒測定，方法參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以Means±SD表示。采用SPSS13.0軟件中One－way ANOVA及Duncan多重比較分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠水解物的制備

采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶制備的明膠水解物，分別定義為AGH1－3或 PGH1－3，而采用中性蛋白酶制備的水解物定義為NGH。7個(gè)明膠水解物的水解度在4.7%～13.5%，制備條件如表1所示。由于蛋白水解物的抗氧化活性大小與水解度有關(guān)［7］，因此，可以評(píng)價(jià)抗氧化活性不同的明膠水解物對(duì)大鼠肝細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用，以及抗氧化活性與細(xì)胞保護(hù)作用之間的關(guān)聯(lián)。

表1 7個(gè)明膠水解物的水解條件及水解度Table1 The conditions of hydrolysis and DH of seven hydrolysates

2.2 明膠水解物抗氧化活性

2.2.1 對(duì)DPPH自由基清除能力 明膠水解物對(duì)DPPH自由基有清除作用。它對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增強(qiáng)(圖1)，呈現(xiàn)明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。木瓜酶水解物、堿性酶水解物和中性酶水解物在添加量為64mg/mL時(shí)達(dá)到最大清除率，分別為59.0%、56.8%、61.3%。在相同濃度下，對(duì)DPPH自由基的清除率隨明膠水解物水解度的增高而逐漸增強(qiáng)。這一點(diǎn)與文獻(xiàn)結(jié)果［20］一致。

圖1 明膠水解物清除DPPH自由基的能力Fig.1 The ability of scanvaging DPPH radicals of gelatin hydrolysates

2.2.2 對(duì)羥自由基清除能力 羥自由基屬于活性氧的一種，是最活潑的自由基，可以引起生物大分子損傷。因此，研究明膠水解物對(duì)羥自由基的清除能力對(duì)抗氧化性研究具有重要意義。圖2數(shù)據(jù)表明，明膠水解物對(duì)羥自由基的清除率隨濃度、水解度的增加而增強(qiáng)，并呈劑量依賴性關(guān)系。然而，水解度最大的明膠水解物AGH3在最大濃度時(shí)，其清除率僅為33.3%，這說明明膠水解物對(duì)羥自由基清除能力較弱。

圖2 明膠水解物清除羥自由基的能力Fig.2 The ability of scanvaging hydroxyl free radical of gelatin hydrolysates

2.2.3 對(duì)超氧陰離子清除能力 超氧陰離子能加速脂肪氧化和生物體衰老，誘發(fā)炎癥或癌癥等疾病。鄰苯三酚自氧化法常用于測定超氧陰離子的清除能力。由圖3的數(shù)據(jù)可以看出，明膠水解物對(duì)超氧陰離子的清除率隨質(zhì)量濃度的增加和水解度的加大而呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢，并成顯著的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為64mg/mL時(shí)，PGH3最大的清除率為96.5%。可見明膠水解物對(duì)超氧陰離子具有極強(qiáng)的清除能力。

圖3 明膠水解物清除超氧陰離子的能力Fig.3 The ability of scanvaging superoxide anion radicals of gelatin hydrolysates

2.3 明膠水解物對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的重要細(xì)胞器，H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，造成線粒體的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［21］。表2數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)肝細(xì)胞與H2O2作用2h后，細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化損傷，細(xì)胞存活率顯著下降至29.0%(p＜0.05)。處理組中，當(dāng)AGH3在2mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率提高至56.3%，而PGH2在1mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率僅提高至30.8%。結(jié)果表明明膠水解物預(yù)先與細(xì)胞作用24h，再加入 H2O2氧化損傷2h后，細(xì)胞存活率總體上可顯著提高(p＜0.05)。

細(xì)胞由于氧化損傷，細(xì)胞膜的完整性受到破壞，乳酸脫氫酶(LDH)釋放至培養(yǎng)液，其滲出量可間接反映細(xì)胞的損傷程度［22］。如表2所示，當(dāng)肝細(xì)胞與H2O2作用2h后，培養(yǎng)液內(nèi)的LDH含量達(dá)到575.0U/L，這表明細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化損傷。然而，明膠水解物預(yù)先作用24h后，可顯著降低LDH的滲出量(p＜0.05)。處理組中，添加AGH3在2mg/mL時(shí)，培養(yǎng)液中的LDH滲出量降低至375.7U/L(p＜0.05)。

丙二醛(MDA)的生成量是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的敏感指標(biāo)，MDA能夠破壞蛋白質(zhì)等生物大分子，造成機(jī)體多種疾病的發(fā)生［23］。因此，測定H2O2損傷的肝細(xì)胞內(nèi)的MDA含量可以鑒定明膠水解物對(duì)細(xì)胞抗氧化的保護(hù)作用。表2數(shù)據(jù)顯示，正常組細(xì)胞內(nèi)MDA含量僅為9.1nmol/mg蛋白，而當(dāng)H2O2損傷細(xì)胞2h后，MDA含量達(dá)到29.0nmol/mg蛋白(p＜0.05)。當(dāng)明膠水解物預(yù)先作用24h后，可以顯著抑制細(xì)胞內(nèi)的MDA生成量(p＜0.05)，添加AGH3為2mg/mL的培養(yǎng)液中的MDA含量達(dá)到17.6nmol/mg蛋白。

表2 不同濃度明膠水解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷肝細(xì)胞的影響Table2 The impacts of different gelatin hydrolysates on H2O2－induced the oxidative stress in BRL cells

谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡主要的非酶調(diào)節(jié)劑，當(dāng)細(xì)胞受到氧化脅迫時(shí)，GSH的含量迅速降低［24］。從表2結(jié)果可以看出，當(dāng)BRL細(xì)胞與H2O2作用2h后，細(xì)胞內(nèi)的GSH含量顯著下降至56.8nmol/mg蛋白(p＜0.05)。而BRL細(xì)胞與0.5mg/mL的明膠水解物作用2h后，細(xì)胞內(nèi)的GSH含量升高不顯著(p＞0.05)。這可能是由于細(xì)胞在應(yīng)對(duì)氧化損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶的失活造成的［24］。

2.4 明膠水解物的抗氧化活性與細(xì)胞保護(hù)作用之間的相關(guān)性

由前述的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，明膠水解物具有不同的抗氧化活性，而且對(duì)大鼠肝細(xì)胞顯示出不同的保護(hù)作用。因此有必要進(jìn)一步剖析明膠水解物抗氧化性質(zhì)與細(xì)胞保護(hù)作用之間的關(guān)聯(lián)性。表3的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率、LDH滲出量和MDA生成量與明膠水解物的抗氧化活性大小之間具有明顯的相關(guān)性。其中，LDH滲出量、MDA生成量與抗氧化活性大小呈負(fù)相關(guān)(r＜0)，細(xì)胞存活率與抗氧化活性大小呈正相關(guān)(r＞0)。然而，當(dāng)明膠水解物濃度為1.0mg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH含量水平與體外化學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)間不具有明顯的相關(guān)性(p＞0.05)。總體上，明膠水解物抗氧化性在細(xì)胞體系中評(píng)價(jià)結(jié)果與化學(xué)方法評(píng)價(jià)結(jié)果具有一致性。因此，鮭魚皮明膠水解物對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，與體外清除自由基能力存在一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論

3.1 本研究利用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解明膠，制備出水解度在4.7%到13.5%的7個(gè)明膠水解物。通過測定其對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子指標(biāo)的清除活性，表明明膠水解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且抗氧化活性隨著明膠水解物水解度的增大呈增強(qiáng)趨勢。

3.2 通過大鼠BRL肝細(xì)胞損傷模型，證明明膠水解物對(duì)大鼠肝細(xì)胞的H2O2誘導(dǎo)損傷具有保護(hù)作用。可以顯著的增加細(xì)胞存活率，降低LDH滲出量和胞內(nèi)MDA生成量;不過，細(xì)胞內(nèi)GSH含量變化不顯著。明膠水解物對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響，還有待進(jìn)一步研究。

3.3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，7個(gè)明膠水解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(細(xì)胞存活率增加，以及LDH滲出量和MDA生成量降低)，與水解物的體外抗氧化活性存在很好的相關(guān)性。因此可以推測，鮭魚皮明膠水解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)BRL大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用方式，與其清除自由基相關(guān)。

表3 氧化損傷體系中指標(biāo)與體外化學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)間相關(guān)性Table3 Correlation between the celluar indices of oxidative stress and indices of chemical evaluation in vitro

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