2種氨基酸與葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性研究

董 樂

(泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建泉州 362000)

美拉德反應(yīng)是非酶褐變反應(yīng)，主要指食品中的氨基化合物與羰基化合物發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)。20世紀(jì)中葉以來，已有大量關(guān)于美拉德反應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道［1－4］，主要研究美拉德反應(yīng)的機(jī)理及產(chǎn)物。近20年來，發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard Reaction Products，簡稱為MRPs)具有一定的抗氧化作用，關(guān)于美拉德反應(yīng)的一大研究領(lǐng)域是其產(chǎn)物的抗氧化性［5］。較完全的美拉德反應(yīng)生成物有上千種，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)十分復(fù)雜，劉平等通過超濾及葡聚糖凝膠色譜技術(shù)結(jié)合將美拉德產(chǎn)物按分子量大小分級(jí)成小于1000、1000～5000和大于5000u三個(gè)組分，大于5000u的美拉德產(chǎn)物在較低濃度下DPPH自由基清除率達(dá)90%［6－7］。研究者大多用單一的糖與氨基酸反應(yīng)，通過控制糖、氨基酸種類和反應(yīng)條件來生成不同組成的美拉德產(chǎn)物混合物。不同反應(yīng)物和反應(yīng)條件的美拉德產(chǎn)物的抗氧化性有著明顯的差異。郭麗萍等以木糖和甘氨酸為底物，控制不同的物質(zhì)的量進(jìn)行美拉德反應(yīng)，研究了物質(zhì)的量與MRPs抗氧化能力之間的關(guān)系［8］。張嚴(yán)等研究了反應(yīng)條件對(duì)MRPs的褐變程度、熒光吸收強(qiáng)度以及其抗氧化活性的影響［9］。微波加熱在食品工業(yè)中已廣泛應(yīng)用，但利用微波加熱促進(jìn)美拉德反應(yīng)鮮見報(bào)道。本文通過脯氨酸、L－精氨酸分別與葡萄糖在微波加熱下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，并以抗氧化效果為指標(biāo)優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件，為MRPs作為天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脯氨酸、L－精氨酸、無水葡萄糖、DPPH(1，1－二苯基－2－苦基苯肼)、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等試劑 均為國產(chǎn)分析純。

格蘭仕光波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司;V－1100型可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司;微機(jī)型臺(tái)式pH計(jì) 上?？祪x儀器有限公司;FA2104型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化活性測定－DPPH法［10］通過比色法來檢測MRPs對(duì)DPPH自由基(DPPH·)的清除率，用以表征其抗氧化性。由于苯環(huán)的共軛和位阻及硝基的電子作用，DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，DPPH·的單電子被配對(duì)而使其紫色變淺，吸光度變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關(guān)系，因此用其來檢測自由基清除情況，以判斷MRPs的抗氧化能力。

取MRPs兩份，各2mL。一份加入2mL 2×10－4mol/L DPPH溶液，另一份加入2mL無水乙醇;再取2mL 2×10－4mol/L DPPH溶液，加入2mL無水乙醇。常溫下反應(yīng)30min，分別測定其在517nm處的吸光度值，平行測定3次。自由基的清除率計(jì)算公式為:

式中:A0為乙醇溶液與DPPH溶液的吸光度值;Ai為MRPs與DPPH溶液的吸光度值;Aj為MRPs與乙醇溶液的吸光度值。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs抗氧化性的影響 稱取脯氨酸1.150g，無水葡萄糖1.980g，使脯氨酸的氨基與葡萄糖的羰基摩爾比為1∶1，將其完全溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為9，定容至100mL。稱取L－精氨酸1.740g，無水葡萄糖1.980g，使L－精氨酸的氨基與葡萄糖的羰基摩爾比為1∶1，調(diào)溶液的pH為10.6，并定容至100mL。分別取15mL反應(yīng)液于消化管中，置于微波爐，微波功率為800W，加熱 1、2、3、4、5、6min后取出，待反應(yīng)液冷卻至室溫后測定其對(duì)DPPH·的清除率。

1.2.2.2 微波功率對(duì)MRPs抗氧化性的影響 稱取脯氨酸1.150g，無水葡萄糖1.980g，使脯氨酸的氨基與葡萄糖的羰基摩爾比為1∶1，將其完全溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其 pH為9，定容至100mL。稱取L－精氨酸1.740g，無水葡萄糖1.980g，使L－精氨酸的氨基與葡萄糖的羰基摩爾比為1∶1，調(diào)溶液pH為10.6并定容至100mL。分別取15mL反應(yīng)液于消化管中，置于微波爐，調(diào)整微波功率分別為160、320、480、640、800W加熱，5min后取出，待反應(yīng)液冷卻至室溫后測定其對(duì)DPPH·的清除率。

1.2.2.3 不同pH對(duì)MRPs抗氧化性的影響 稱取脯氨酸1.150g，無水葡萄糖1.980g，使脯氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的摩爾比為1∶1，將其完全溶解，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)其 pH 分別為 3、5、7、9、11，定容至100mL。稱取L－精氨酸1.740g，無水葡萄糖1.980g，使L－精氨酸的氨基與葡萄糖的羰基摩爾比為1∶1，溶解調(diào) pH 分別為 7、8、9、10、11，并定容至 100mL。分別取15mL反應(yīng)液于消化管中，置于微波爐，微波功率為800W，加熱5min后取出，待反應(yīng)液冷卻至室溫后測定其對(duì)DPPH·的清除率。

1.2.2.4 氨基與羰基比對(duì)MRPs抗氧化性的影響 分別稱取脯氨酸(0.230、0.230、0.230、0.460、0.575g)、L－ 精 氨 酸 (0.348、0.348、0.348、0.696、0.870g) 和 葡 萄 糖 (0.396、0.792、1.188、0.396、0.396g)，使脯氨酸、L－精氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的摩爾比為 1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2.5∶1，并將其分別完全溶解，脯氨酸組pH調(diào)至9并定容至20mL，L－精氨酸組pH調(diào)至10.6并定容至20mL。分別取15mL反應(yīng)液于消化管中，置于微波爐，微波功率為800W，加熱5min后取出，待反應(yīng)液冷卻至室溫后測定其對(duì)DPPH·的清除率。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素實(shí)驗(yàn)，得出了單個(gè)因素的最適條件。選擇加熱時(shí)間(A)、微波功率(B)、pH(C)、氨基與羰基摩爾比(D)4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平L9(34)3重復(fù)正交實(shí)驗(yàn)，脯氨酸組和L－精氨酸組的因素水平設(shè)計(jì)分別見表1、表2。

表1 脯氨酸正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Experiment factor and level of glucose－proline

表2 L－精氨酸正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table2 Experiment factor and level of glucose－arginine

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs抗氧化性的影響 由圖1可知，在加熱時(shí)間為1～5min時(shí)，MRPs對(duì)DPPH·清除率隨時(shí)間的增加而增加，5min時(shí)脯氨酸DPPH·清除率達(dá)到最高，隨著加熱時(shí)間的進(jìn)一步延長，脯氨酸的MRPs對(duì)DPPH清除率反而有所下降，這可能是反應(yīng)體系中的產(chǎn)物隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而發(fā)生了改變，使得抗氧化性減弱。L－精氨酸的MRPs對(duì)DPPH·清除率高于脯氨酸，該條件下美拉德反應(yīng)時(shí)間選定5min。

2.1.2 微波功率對(duì)MRPs抗氧化性的影響 由圖2可知，隨著微波功率的增加，MRPs對(duì)DPPH·清除率呈現(xiàn)逐漸增大趨勢。主要因?yàn)槲⒉t的輸出功率大，微波發(fā)射次數(shù)也多，反應(yīng)物溫度上升較快，高溫有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。微波功率達(dá)480W后抗氧化性上升幅度加快，L－精氨酸MRPs的抗氧化性高于脯氨酸近一倍。

圖1 不同加熱時(shí)間下MRPs對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.1 Effect of microwave heating time on DPPH radical scavenging activity of MRPs

圖2 不同微波功率下MRPs對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.2 Effect of microwave power on DPPH radical scavenging activity of MRPs

2.1.3 不同pH對(duì)MRPs抗氧化性的影響 由圖3可知，pH對(duì)MRPs抗氧化活性的影響有一定規(guī)律，體系pH接近氨基酸的等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，易形成沉淀物，影響了美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。在酸性條件下，脯氨酸的MRPs對(duì)DPPH·清除率比較強(qiáng)，而在堿性條件下，其清除率有所下降。這可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)在酸性條件下生成的一些小分子(如噻吩、噻唑、噁唑、呋喃等)具有抗氧化活性，而在堿性條件下生成的大量吡嗪類小分子卻沒有抗氧化活性［11］。L－精氨酸的MRPs抗氧化性高于脯氨酸，且隨著pH的升高而降低。

圖3 不同pH下MRPs對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of pH on DPPH radical scavenging activity of MRPs

2.1.4 氨基與羰基比對(duì)MRPs抗氧化性的影響 由圖 4 可知，在氨基與羰基比 1∶1、1∶2、1∶3 時(shí)，隨葡萄糖量增加，MRPs對(duì)DPPH·清除率也隨著增強(qiáng)。當(dāng)氨基與羰基比1∶3時(shí)MRPs的DPPH·清除率最大。氨基與羰基比為2∶1、2.5∶1 時(shí)，脯氨酸 MRPs的 DPPH·清除率略有下降，而L－精氨酸MRPs的DPPH·清除率有較大幅度的下降。

圖4 不同氨基與羰基比下MRPs對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.4 Effect of molar ratios of amine group to carbonyl group on DPPH radical scavenging activity of MRPs

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)表，分別在相應(yīng)條件下反應(yīng)得到MRPs，并對(duì)所得MRPs抗氧化活性進(jìn)行測定，結(jié)果如表3、表4所示。

表3 脯氨酸正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 The result of glucose－proline orthogonal test

由表3、表4極差結(jié)果分析可知:影響MRPs抗氧化活性的最主要因素，脯氨酸美拉德反應(yīng)是微波功率，其次是時(shí)間，再次是pH，影響最小的為比例因素，即主次順序:B＞A＞C＞D。L－精氨酸美拉德反應(yīng)影響MRPs抗氧化活性的最主要因素是時(shí)間，其次是微波功率，再次是pH，影響最小的為比例因素，即主次順序:A＞B＞C＞D。脯氨酸和L－精氨酸與葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生MRPs抗氧化活性的優(yōu)化水平分別為:A2B3C2D3和A3B3C1D2。

2.2.2 方差分析 根據(jù)表5方差分析表，不考慮交互作用，正交實(shí)驗(yàn)的正交表沒有空白列，所以在方差分析時(shí)沒有體現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驼`差，只有實(shí)驗(yàn)誤差。F檢驗(yàn)結(jié)果表明，時(shí)間(A)、微波功率(B)、pH(C)、氨基與羰基比(D)4因素對(duì)MRPs的抗氧化性質(zhì)都有極顯著影響。

表4 L－精氨酸正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 The result of glucose－arginine orthogonal test

表5 方差分析表Table5 Results of variance analysis

用最小顯著極差法(LSR法)q檢驗(yàn)進(jìn)行各因素各水平均值的清除率差異顯著性比較，脯氨酸和L－精氨酸美拉德反應(yīng)實(shí)驗(yàn)各因素中，時(shí)間(A)、微波功率(B)、pH(C)選擇的水平與其他水平均有顯著的差異，脯氨酸美拉德反應(yīng)實(shí)驗(yàn)氨基與羰基比(D)因素的1、3水平間差異不顯著，從原料利用率考慮，選擇1∶2.5的1水平，最優(yōu)方案應(yīng)為 A2B3C2D1。L－精氨酸美拉德反應(yīng)實(shí)驗(yàn)氨基與羰基比(D)因素的2、3水平間差異不顯著，同樣從原料利用率考慮，選擇2∶1的3水平，最優(yōu)方案應(yīng)為A3B3C1D3。

按最優(yōu)組合條件A2B3C2D1、A3B3C1D3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并與參試組合條件下反應(yīng)所得MRPs比較對(duì)DPPH·的清除能力，最優(yōu)組合條件下脯氨酸和L－精氨酸與葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs對(duì)自由基的清除率分別為:98.94%、96.81%，高于參試組合條件反應(yīng)所得MRPs的最大值97.22% 和93.51%，說明正交實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)組合條件制備的MRPs具有最強(qiáng)抗氧化活性。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以脯氨酸、L－精氨酸和葡萄糖為模型，對(duì)微波加熱條件下 MRPs的抗氧化性進(jìn)行研究，用MRPs對(duì)DPPH·的清除率來表征其抗氧化性。利用正交實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間、微波功率、反應(yīng)初始pH、脯氨酸和L－精氨酸與葡萄糖的摩爾比4個(gè)因素對(duì)MRPs抗氧化活性的影響。結(jié)果表明:相比于普通加熱方式，微波加熱不僅可以縮短加工時(shí)間，降低生產(chǎn)成本，而且可提高產(chǎn)率和產(chǎn)品的保藏性［12］。微波加熱條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，其反應(yīng)時(shí)間明顯快于一般加熱方法。魯偉、張凌燕等對(duì)精氨酸與葡萄糖MRPs抗氧化性研究，最佳保溫時(shí)間是 60～120min［13－14］，微波加熱只需 5min。微波是否改變了美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物及進(jìn)程，使其產(chǎn)物更具有抗氧化性還有待于進(jìn)一步研究。

脯氨酸、L－精氨酸與葡萄糖的MRPs均有較高的抗氧化性，對(duì)DPPH·的清除率分別達(dá)到98.94%和96.81%。并且是食品加工和儲(chǔ)藏過程中產(chǎn)生的一類物質(zhì)，可以認(rèn)為是天然的，這給尋找和生產(chǎn)天然抗氧化劑提供了新的思路。

不同反應(yīng)物反應(yīng)條件得到的MRPs具有不同程度的抗氧化能力，考察的反應(yīng)時(shí)間、微波功率、反應(yīng)初始pH、脯氨酸、L－精氨酸與葡萄糖摩爾比4個(gè)因素對(duì)MRPs抗氧化活性的影響均極顯著。影響MRPs抗氧化活性的主次順序，脯氨酸為:微波功率＞加熱時(shí)間＞pH＞氨基與羰基比。L－精氨酸為:加熱時(shí)間＞微波功率＞pH＞氨基與羰基比。MRPs抗氧化活性的最優(yōu)反應(yīng)條件，脯氨酸為:微波功率800W，加熱時(shí)間5min，pH5，氨基與羰基比 1∶2.5。L－精氨酸為:加熱時(shí)間5min，微波功率800W，pH8，氨基與羰基比2∶1。

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