費菜多酚含量的測定及體外抗菌活性研究

強 毅，王政軍，陳克克，韓 軍，孫鐵峰

(1.陜西師范大學生命科學學院，陜西西安 710062;2.西安文理學院生物技術(shù)學院，陜西西安 710065)

植物多酚(Plant Polyphenols)是多羥基酚類化合物的總稱，是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，分子內(nèi)含有多于一個或幾個苯環(huán)相連的羥基化合物［1］，具有很好的抗菌消炎、抗氧化、酶活性抑制、防輻射突變、抗衰老、降血壓、增強免疫力等作用，可預(yù)防與治療多種疾病，在食品工業(yè)中作為天然添加劑被廣泛用作防腐劑、抗氧化劑和澄清劑等［2－3］。費菜(Sedum aizoon L)為景天科(Crassulaceae)景天屬(Sedum)多年生草本植物，分布于陜西、江蘇、河南、湖北、寧夏和山東等多個省區(qū)，以根及全草入藥，為秦嶺“太白七藥”之一，具有散瘀止血、安神、解毒之功效，含有黃酮與酚類、生物堿、谷甾醇、齊墩果酸、景慶庚糖等藥用成分，主治出血、損傷、心悸、失眠、毒蟲蜇傷等癥［4］;費菜莖葉可食，被收于明朝朱橚所著《救荒本草》，作為野生蔬菜具有心血管保健的功效，被稱為養(yǎng)心草［5］，同時也是多酚的資源植物之一［6］。本文使用福林酚法(Folin－Ciocalteu，F(xiàn)C)對費菜不同部位70%甲醇提取物中的多酚含量予以測定，并采用牛津杯法、MIC和MBC法綜合評價費菜提取物對10種細菌的抑制作用，以期為綜合開發(fā)利用費菜資源提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物材料 采自陜西省西安市灞橋區(qū)，經(jīng)陜西師范大學田先華教授鑒定為景天科景天屬植物費菜(Sedum aizoon L.)，干燥后將其地上、地下部分分離，粉碎并過40目篩，保存?zhèn)溆?蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)A18、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A20、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)A21、大腸桿菌(Escherichia coli)A70、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)A89、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)A113、藤黃八疊球菌(Sarcina luteu)A119、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)26003、表皮葡萄球菌(Staphyloccocus epidermidis)1.2429、肺炎克雷伯氏菌(Keleiboshijun ganran)1.1736 北京微生物研究所;沒食子酸標準品 中國藥品生物制品檢定所;Folin－Ciocalteu試劑 上海荔達生物科技有限公司;四環(huán)素 Wolsen公司;二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;Mueller－Hinton Agar培養(yǎng)基(MHA)、MH 肉湯培養(yǎng)基(MHB) 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;甲醇 西安化學試劑廠;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

TU－1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FZ102微型植物粉碎機 黃驊市中興有限責任公司;Q/BKYY31－2000型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;SL202N型藥物電子天平 上海明橋精密科學儀器有限公司;HH－6B數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;索氏提取裝置，超凈工作臺，不銹鋼數(shù)顯卡尺等，牛津杯(內(nèi)徑6mm，外徑7mm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚含量測定

1.2.1.1 樣品溶液的制備 精確稱取費菜地上與地下部分植物材料各10.0g，分別使用70%甲醇100mL熱回流提取兩次，每次3h，過濾后合并濾液，定容至200mL，即為費菜不同部位多酚提取液。

1.2.1.2 沒食子酸對照品溶液的配制 精確稱取已烘干至恒重的沒食子酸標準品(純度≥95%)13mg，用甲醇溶解并定容至50mL，即得終濃度為0.26mg/mL沒食子酸標準品溶液。

1.2.1.3 沒食子酸標準曲線的制備 分別精密吸取沒食子酸標準品溶液 0、0.1、0.4、0.5、0.6、0.8mL 置于25mL量瓶中，向量瓶中依次加入10.0mL蒸餾水，再各加入Folin－Ciocalteu顯色劑2.0mL，充分振蕩后靜置6min，分別加入15%Na2CO3溶液2.0mL，蒸餾水定容后搖勻，在室溫下避光放置反應(yīng)2h。以第1瓶溶液作為空白對照，于765nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次。根據(jù)沒食子酸溶液的濃度和吸光度值，繪制標準曲線。

1.2.1.4 樣品的含量測定 分別取樣品溶液50μL，按照1.2.1.3沒食子酸標準曲線的制備方法進行實驗，測定費菜樣品中多酚的含量，重復(fù)3次。

1.2.1.5 精密度實驗 分別取3份地下部分樣品，參考1.2.1.1樣品溶液的制備方法，1.2.1.4樣品的含量測定方法，在相同的條件下分別進行6次平行測定，檢測方法的精密度。

1.2.1.6 穩(wěn)定性實驗 將上述樣品溶液每隔1h測定1次吸光度，重復(fù)3次，連續(xù)測定4次，考察4h內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.1.7 重復(fù)性實驗 分別取3份樣品，參考1.2.1.1樣品溶液的制備方法平行制備，分別測定吸光度，考察其重復(fù)性。

1.2.1.8 加樣回收率實驗 精密吸取25μL已知濃度的樣品溶液各3份，各組分別精密加入已知含量沒食子酸標準品溶液25μL，按1.2.1.3沒食子酸標準曲線的制備方法顯色后，以不含樣品的溶液作為空白對照，于765nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次，計算加樣回收率。

1.2.2 抗菌活性研究

1.2.2.1 菌懸液的制備 將供試菌在MHA斜面培養(yǎng)基上活化，37℃培養(yǎng)12h。用接種環(huán)挑取適量菌體于0.9%的生理鹽水中，當OD600值在0.15～0.25之間，其對應(yīng)細菌數(shù)目應(yīng)為106～108CFU/mL，即為實驗用菌懸液。

1.2.2.2 樣品溶液的制備 精確稱取費菜材料50.0g，70%甲醇熱回流連續(xù)提取兩次，每次3h，過濾后合并濾液，干燥箱烘干(45～50℃)。提取物用DMSO溶解，配制成濃度為200mg/mL的樣品溶液，同時用無菌水配制濃度為0.5mg/mL的鹽酸四環(huán)素溶液作陽性對照，過濾除菌。

1.2.2.3 抗菌活性實驗 抑菌圈實驗采用牛津杯法測定［7］。將已滅菌的MHA培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基平板冷凝后，吸取0.1mL菌懸液滴加至平板中涂布均勻。每個培養(yǎng)皿放置3個牛津杯，每個牛津杯中加入100mg/mL的樣品溶液50μL，另設(shè)陽性對照為0.5mg/mL鹽酸四環(huán)素，陰性對照為DMSO溶液。將培養(yǎng)皿4℃固定2h后轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)箱，12h后測定抑菌圈。每組實驗重復(fù)3次。

最小抑菌濃度(MIC)采用96孔板法測定［8］。將MHB培養(yǎng)基與菌懸液按20∶1混勻后取100μL加入96孔板中，于第1孔中加入200mg/mL的樣品溶液100μL混勻，采用倍半稀釋法稀釋至第11孔，并從第11孔中吸取100μL棄去，第12孔作為陰性對照，不含樣品溶液。向每孔中分別加入5μL菌懸液。陽性對照組用鹽酸四環(huán)素替代樣品溶液。將加好樣的96孔板密封后置于4℃冰箱1h后放入37℃培養(yǎng)箱，12h后觀察。以肉眼觀察，無渾濁者，即為受試菌的最小抑菌濃度(MIC)。每組實驗重復(fù)3次。

最小殺菌濃度(MBC)采用 96 孔板法測定［9－10］。將每個 MIC前(包括 MIC)的混合液取5μL，移入100μL新鮮MHB培養(yǎng)基的96孔板中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h后觀察，無混濁者即能殺死99.5%原始種入的細菌，為該菌的最低殺菌濃度(MBC)。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 費菜多酚含量的測定

2.1.1 沒食子酸標準曲線繪制結(jié)果 以沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標，相應(yīng)吸光度值為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線(圖1)，得回歸方程:y=0.1282x+0.0142，相關(guān)系數(shù) R2=0.9985，RSD(n=3)=1.58%。實驗結(jié)果表明，沒食子酸標準品溶液濃度在1.04～8.32μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.1.2 樣品中多酚含量測定結(jié)果 根據(jù)沒食子酸標準曲線的回歸方程，算出費菜不同部位多酚含量。由表1可知，費菜地上部分和地下部分多酚含量分別為45.59±0.87和96.25±0.47mg/g(以沒食子酸量/干材料表示，n=3)。

表1 費菜多酚含量測定結(jié)果Table1 Contents of total polyphenols in Sedum aizoon L.

費菜作為藥食兩用植物，以根或全草入藥，地上部分的莖葉亦可食用，一般地下部分在春秋季采挖，全草隨用隨采［11］;根據(jù)測定的結(jié)果，地下部分作為費菜最重要的藥用部位，其多酚含量是地上部分的兩倍以上，但地上部分一年可多次采收，畝產(chǎn)可達8000kg，資源量較大，因此，開展費菜全草綜合利用研究對于費菜工業(yè)化開發(fā)利用具有重要意義。

2.1.3 精密度實驗結(jié)果 由表2可知，精密度實驗RSD為0.14%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果 由表3可知，穩(wěn)定性實驗RSD為0.22%，表明待測樣品溶液在4h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性實驗結(jié)果 由表4可知，重復(fù)性實驗RSD為0.15%，表明方法重復(fù)性良好。

表2 精密度實驗結(jié)果Table2 Result of precision test

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table3 Result of stability test

表4 重復(fù)性實驗結(jié)果Table4 Result of repetitive test

2.1.6 加樣回收率實驗 加樣回收率實驗結(jié)果見表5，加樣回收率實驗RSD為0.75%，表明方法的準確率較高。

2.2 抑菌活性結(jié)果與分析

費菜提取物對8種常見的細菌具有一定的抑制作用，具有廣譜抗菌的效果。尤其是對于藤黃八疊球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌，其抑菌圈大小分別為13.97±0.8、13.94±0.4、13.63±0.4和12.39±0.5mm，但對表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌均無抑制作用，結(jié)果見表6。

2.3 MIC和MBC結(jié)果與分析

費菜提取物在較低的濃度下對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強的抑菌和殺菌作用，其MIC、MBC分別為6.25、25mg/mL。對于巨大芽孢桿菌和藤黃八疊球菌，費菜提取物有一定的抑菌效果，但殺菌作用不甚明顯。費菜提取物對凝結(jié)芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌以及白色葡萄球菌的MIC大于或等于25mg/mL，MBC大于或等于50mg/mL，說明對這5種菌均無明顯的殺菌抑菌作用，實驗結(jié)果見表7。

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是引起食品污染和細菌性食物中毒的一種重要細菌，在自然界中分布廣泛，其致病力主要取決于產(chǎn)毒素和酶的能力，主要有溶血毒素、腸毒素、血漿凝固酶和耐熱核酸酶等［12］;植物多酚可以破壞金黃色葡萄球菌細胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞通透性增加和細胞內(nèi)容物外泄，同時，通過影響細菌核酸、磷脂等細胞重要成分的合成及能量代謝，阻礙細菌蛋白正常表達，從而影響其細胞的結(jié)構(gòu)組成以及酶的催化活性，最終導(dǎo)致細菌正常生理功能的喪失［13］。由于多酚類物質(zhì)的組成及含量差異導(dǎo)致不同植物來源的多酚提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用不同，目前，我們正在對費菜多酚的組成及其抗菌機制進行進一步研究，以期開發(fā)出新的可用于工業(yè)化應(yīng)用的天然抗菌劑。

表5 多酚加樣回收率實驗結(jié)果Table5 Results of recoveries tests

表6 費菜提取物的抑細菌圈直徑(mm)Table6 Diameter of inhibition zone of Sedum aizoon L.(mm)

表7 費菜提取物對10種病原菌的MIC和MBCTable7 MICs and MBCs of Sedum aizoon L.to 10 species of pathogenic microorganisms

3 結(jié)論

3.1 植物多酚是植物主要成分之一，具有重要的生理活性，不同產(chǎn)地的氣候與生態(tài)環(huán)境以及藥用植物種質(zhì)間的基因差異均會影響其形成與積累，同一植物不同部位的多酚含量也會有所差異。本實驗采用的福林酚試劑法作為測定多酚含量的常規(guī)方法之一，較高錳酸鉀法、酒石酸亞鐵法、普魯士蘭法等方法準確度和精密度更高、穩(wěn)定性更好［14－15］，可用于有效成分的檢驗和質(zhì)量控制。實驗表明費菜地上部分和地下部分多酚含量分別為45.59±0.87、96.25±0.47mg/g(以沒食子酸量/干材料表示，n=3)，多酚含量較高，尤以地下部分多酚含量最高。同時，費菜是我國傳統(tǒng)藥材，其來源植物分布廣泛，種植栽培容易，資源量極大，可以為其工業(yè)化應(yīng)用提供良好的原料保障。

3.2 實驗中選取了具有代表性的微生物檢測費菜提取物的抗菌活性，結(jié)果表明費菜提取物對多種細菌具有一定的抗菌效果，特別是對能引起細菌性食物中毒、易產(chǎn)生耐藥性的金黃色葡萄球菌抗菌效果明顯。

費菜作為一種藥食兩用植物，其多酚含量高，抗菌活性強，資源量大，可廣泛用于食品、藥品以及化妝品等工業(yè)生產(chǎn)，具有進一步開發(fā)利用的價值。

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