紫菜酶解物的制備及其特性

鄭惠彬，鄭溫翔，翁武銀

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門 361021)

我國(guó)是紫菜生產(chǎn)大國(guó)，2010年產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到10.7萬(wàn)t［1］。其中，福建省近年來(lái)實(shí)現(xiàn)了壇紫菜品種改良技術(shù)的突破，紫菜產(chǎn)量逐年遞增，目前已經(jīng)達(dá)到全國(guó)的47.7%［1］。然而，由于紫菜加工長(zhǎng)期停留在干制品和烤紫菜層面，精深加工品種少，結(jié)果導(dǎo)致高產(chǎn)量的紫菜沒(méi)有實(shí)現(xiàn)更大的經(jīng)濟(jì)效益回報(bào)。紫菜含有豐富的人體必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，屬于高蛋白、低脂肪的理想保健食品原料［2］。有研究報(bào)道顯示，紫菜提取物不僅具有降壓功效［3］，還具有一定的抗腫瘤效果［4］。然而，由于紫菜具有特殊的細(xì)胞壁，它在人體內(nèi)是一種不容易消化的食品［5］，因此有必要利用體外酶解方式對(duì)紫菜進(jìn)行深加工，提高人體對(duì)紫菜功效成分的消化吸收，有效利用紫菜中的營(yíng)養(yǎng)成分。利用酶解方法，Sheih等［6］采用胃蛋白酶從海藻加工副產(chǎn)物中提取了具有良好抗氧化活性功能的蛋白肽，姚興存等［7］采用木瓜蛋白酶制備了具有降血壓活性的條斑紫菜蛋白寡肽。本文針對(duì)紫菜的細(xì)胞壁，將利用纖維素酶結(jié)合木瓜蛋白酶對(duì)紫菜進(jìn)行酶解，初步探討紫菜酶解物的自由基清除能力和理化特性，為紫菜深加工提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

壇紫菜干制品 購(gòu)于廈門集美農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，根據(jù)凱氏定氮法獲知紫菜蛋白含量為34.3%;冰乙酸、硼酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉 廣東光華化學(xué)廠有限公司;鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、一水合檸檬酸、抗壞血酸 西隴化工股份有限公司;檸檬酸鈉、硼砂上海恒信化學(xué)試劑有限公司;纖維素酶 酶活力10000U·g－1，北京生物技術(shù)有限公司;木瓜蛋白酶 酶活力650000U·g－1，廣西南寧龐博生物工程有限公司;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH) 日本和光純藥株式會(huì)社;實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman有限公司;UV－2600A型紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;日立835－50型高速氨基酸分析儀 日本日立制造所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫菜酶解物的制備 紫菜酶解物的制備是根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)文獻(xiàn)［8］報(bào)道的方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)母膭?dòng)，也就是將干紫菜與1mg/mL的酶液以4∶100的固液比混合均勻，將溶液pH調(diào)至5.5后利用55℃水浴酶解。酶解一段時(shí)間后，利用100℃水浴加熱滅酶5min，冷卻后離心(8000 ×g，4℃，15min)獲得紫菜酶解物上清液。另外，利用復(fù)合酶對(duì)紫菜進(jìn)行酶解時(shí)纖維素酶與木瓜蛋白酶按1∶1的比例混合組成。

酒精溶液與紫菜酶解液按體積比3∶1進(jìn)行攪拌混合均勻后于4℃下浸提一段時(shí)間，離心(10000×g，4℃，20min)后獲得紫菜浸提液，經(jīng)冷凍干燥后獲得紫菜酶解物。

1.2.2 紫菜酶解物的固形物得率及蛋白提取率 將提取后不溶性殘?jiān)胖?05℃烘箱中干燥至恒重，紫菜的固形物得率和蛋白提取率分別按下式計(jì)算:

式中，A為紫菜原料的干重(g);B為紫菜提取后不溶性殘?jiān)母芍?g);a為紫菜酶解物的蛋白含量(g);b為紫菜原料的總蛋白含量(g)。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定［9］在2mL紫菜酶解液(固形物含量為3mg/mL)中加入等體積的0.2mol/L的DPPH酒精溶液，混合均勻后，在暗處?kù)o置30min后測(cè)定其在517nm處的吸光度，同時(shí)以蒸餾水和抗壞血酸作為對(duì)照。DPPH自由基清除率(K)按下式進(jìn)行計(jì)算:

式中，A樣為樣品的吸光度;A對(duì)照為蒸餾水對(duì)照組的吸光度。

1.2.4 氨基酸組成分析 將紫菜粉末和紫菜酶解物粉末利用6mol/L HCl于110℃下水解24h，水解液過(guò)濾后用2mol/L氫氧化鋰溶液將pH調(diào)節(jié)至2.2，經(jīng)0.22μm水系過(guò)濾膜過(guò)濾后，利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定樣品的氨基酸組成。

1.2.5 蛋白溶解性的測(cè)定［10］準(zhǔn)確稱取0.5g紫菜酶解物粉末溶于不同pH的緩沖溶液(pH3～8)中，離心(10000 ×g，4℃，10min)后，利用Lowry法測(cè)定溶解在上清中的蛋白含量，而紫菜酶解物粉末的總蛋白含量根據(jù)微量凱氏定氮法測(cè)定。上清液中的蛋白含量與酶解物粉末總蛋白含量的比值即為紫菜酶解物的蛋白溶解率。

1.2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 將紫菜酶解物粉末溶于6mL 0.2mol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液(pH3)中配制成0.5%的紫菜酶解物溶液，加入2mL食用油，利用均質(zhì)機(jī)在室溫下高速攪拌(11000r/min，1min)制成乳狀液，利用0.1%SDS溶液稀釋50倍后于500nm處測(cè)定吸光值，其中以0.1%SDS溶液替代樣品液作為空白，紫菜酶解物在pH3下的乳化性指數(shù)(EAI，cm2/mg)［11］按下式進(jìn)行計(jì)算:

式中:A為乳狀液在500nm處的吸光值，C為紫菜酶解物的質(zhì)量(mg);φ為乳狀液中油所占的體積比(0.25);

將用于EAI測(cè)定的乳狀液在室溫下靜置30min，再測(cè)定其乳化性指數(shù)EAI'，并根據(jù)下式計(jì)算紫菜酶解物在 pH3 下的乳化穩(wěn)定性(ESI，min)［12］。

式中，Δt為時(shí)間間隔(min)。

另外，按照上述方法測(cè)定紫菜酶解物在 pH7(0.2mol/L磷酸氫二鈉－磷酸二氫鈉緩沖液)和pH9(0.2mol/L硼酸－硼砂緩沖液)下的EAI和ESI。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解方法對(duì)紫菜提取率的影響

圖1顯示了纖維素酶、木瓜蛋白酶及其復(fù)合酶酶解對(duì)紫菜固形物得率和蛋白提取率的影響。從圖1a可以看出，當(dāng)利用纖維素酶對(duì)紫菜進(jìn)行酶解時(shí)，紫菜固形物得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)利用木瓜蛋白酶對(duì)紫菜進(jìn)行酶解時(shí)，紫菜固形物提取率的變化趨勢(shì)與利用纖維素酶進(jìn)行酶解的變化趨勢(shì)基本一致，但提取率出現(xiàn)一定程度的增加。紫菜細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的破碎程度決定了紫菜提取物的得率［13］，細(xì)胞壁主要由膠質(zhì)層與纖維層構(gòu)成，而細(xì)胞膜的主要成分為糖蛋白與磷脂［14］。當(dāng)紫菜經(jīng)過(guò)纖維素酶和木瓜蛋白酶的復(fù)合酶解，固形物提取率明顯提高(圖1a)，表明了纖維素酶和木瓜蛋白酶的共同作用可以促進(jìn)紫菜細(xì)胞破碎溶解。這可能是紫菜在纖維素酶和木瓜蛋白酶的復(fù)合酶解作用下，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜同時(shí)被降解，結(jié)果使紫菜固形物提取率進(jìn)一步增加。王在貴等［15］報(bào)道了蛋白酶雖然對(duì)纖維素酶會(huì)產(chǎn)生一定的分解作用，但纖維素酶的活性仍比較穩(wěn)定。而且，Zhang等［16］還報(bào)道了蛋白酶可以提高纖維素酶的水解效率。因此，可以利用纖維素酶和木瓜蛋白酶對(duì)紫菜進(jìn)行復(fù)合酶解。另一方面，由圖1b可以發(fā)現(xiàn)，利用木瓜蛋白酶酶解得到的蛋白提取率明顯高于纖維素酶，而利用木瓜蛋白酶結(jié)合纖維素酶對(duì)紫菜進(jìn)行復(fù)合酶解時(shí)，尤其經(jīng)過(guò)6h酶解后，蛋白提取率沒(méi)有進(jìn)一步得到提高，表明了纖維素酶主要促進(jìn)紫菜纖維溶解，木瓜蛋白酶則主要使紫菜蛋白溶解。

2.2 紫菜酶解物的抗氧化性

2.2.1 紫菜酶解物的DPPH自由基清除率 利用自由基清除率表征物質(zhì)抗氧化活性是目前普遍采用的方法［17］。由于利用纖維素酶、木瓜蛋白酶及其復(fù)合酶提取的紫菜酶解物中蛋白和多糖成分明顯不同(圖1)，因此通過(guò)測(cè)定紫菜酶解物的DPPH自由基清除率分析紫菜酶解物的抗氧化性，結(jié)果如圖2所示。由圖可以發(fā)現(xiàn)，利用纖維素酶對(duì)紫菜進(jìn)行酶解時(shí)，紫菜酶解物的DPPH自由基清除率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)一定程度的降低，這個(gè)趨勢(shì)與利用復(fù)合酶酶解的結(jié)果類似。然而當(dāng)利用木瓜蛋白酶對(duì)紫菜進(jìn)行酶解時(shí)，紫菜酶解物的DPPH自由基清除率明顯比添加纖維素酶的樣品高。這可能是纖維素酶使酶解物中多糖含量增加，蛋白相對(duì)含量就減少，結(jié)果表明了紫菜酶解的抗氧化性主要來(lái)源于紫菜蛋白及其小分子肽。因此，對(duì)紫菜酶解物的DPPH自由基清除率與蛋白含量之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DPPH自由基清除率隨蛋白含量的增加逐漸上升，而且清除率與蛋白含量之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系(R2=0.92)。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)紫菜固形物得率(a)和蛋白提取率(b)的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction rate of solid(a)and protein(b)from Porphyra haitanensis

圖2 酶解對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates from Porphyra haitanensis

2.2.2 紫菜酶解物中的抗氧化活性物質(zhì)分析 酒精會(huì)使蛋白或大分子肽段、多糖等發(fā)生沉淀，在藻類多糖提取純化過(guò)程中經(jīng)常添加浸提液3倍體積的濃度為95%的酒精使多糖沉淀［18－19］。因此，在本研究中采用終濃度為75%的酒精對(duì)復(fù)合酶酶解的紫菜提取物進(jìn)行浸提，考察了浸提前后紫菜酶解物的DPPH自由基清除率的變化，結(jié)果如表1所示。由表可以看出，無(wú)論酶解時(shí)間長(zhǎng)短，經(jīng)酒精浸提后紫菜酶解物的DPPH自由基清除率都可以得到提高(表1)，表明利用酒精除去酶解物中的部分蛋白質(zhì)、高分子多肽及多糖后，具有抗氧化活性氨基酸或小肽可以得到濃縮，進(jìn)而提高紫菜酶解物的DPPH自由基清除能力。當(dāng)利用抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)酒精浸提獲得的紫菜酶解物的DPPH自由基清除能力大約是抗壞血酸的1/3，但紫菜酶解物主要是由多肽和寡糖組成，對(duì)人體不會(huì)有副作用，將具有更廣闊的應(yīng)用前景。

圖3 DPPH自由基清除率與蛋白含量的關(guān)系Fig.3 Relation between the DPPH radical scavenging activity and the protein content of hydrolysates from Porphyra haitanensis

表1 酒精浸提對(duì)紫菜復(fù)合酶解物DPPH自由基清除率的影響Table1 Effect of alcohol extract on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates from Porphyra haitanensis with composite enzyme

為進(jìn)一步了解酶解過(guò)程和酒精浸提過(guò)程中紫菜提取物成分的變化，對(duì)紫菜及其提取物的氨基酸組成進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表2所示。由表可知，紫菜中富含多種氨基酸，經(jīng)酶解后，除了Cys、His以外，其余氨基酸含量均有一定程度的增加。其中Glu增加最多，其次是 Pro、Tyr、Asp、Gly等，而且這些氨基酸經(jīng)酒精浸提后含量進(jìn)一步得到提高。據(jù)報(bào)道，Pro、Tyr、Met、Lys、Asp、His 是抗氧化肽中的主要氨基酸［20］，尤其Tyr具有酚羥基結(jié)構(gòu)，能提供質(zhì)子從而猝滅自由基。His含有咪唑環(huán)，可以螯合金屬離子擁有良好的抗氧化活性［21］，而且含有His的二肽和三肽都具有很強(qiáng)的自由基清除活性［22］。有報(bào)道顯示，Tyr和Gly氨基酸自身就具備抗氧化活性［23］。因此，紫菜經(jīng)復(fù)合酶解和酒精浸提后，提取物的DPPH自由基清除率可以得到顯著提高(表1)。

2.3 紫菜酶解物的理化特性

以上結(jié)果表明紫菜經(jīng)復(fù)合酶解、酒精浸提后，提取物具備良好的抗氧化活性，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中往往還需要考慮產(chǎn)品的溶解性，乳化性和乳化穩(wěn)定性等理化特性。因此，對(duì)紫菜酶解物的這些理化特性進(jìn)行了考察。

表2 紫菜及其酶解提取物的氨基酸組成(mg/g)Table2 Effect of enzymatic hydrolysis on amino acid composition of Porphyra haitanensis(mg/g)

2.3.1 溶解性 圖4顯示了紫菜酶解物在不同pH下的蛋白溶解性。由圖可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間較短(2h)時(shí)，紫菜提取物在pH6下溶解度為82.5%，而在其他pH條件下則其溶解度都接近100%，表明紫菜蛋白的等電點(diǎn)可能在pH6附近。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，紫菜提取物即使在pH6下其溶解度也逐漸接近100%，表明了酶解提高了紫菜蛋白的溶解性。這主要是紫菜蛋白經(jīng)過(guò)酶解后形成小分子肽和氨基酸，分子由卷曲狀態(tài)成為較伸直的狀態(tài)，分子表面的電荷增加，加強(qiáng)了分子自身之間、分子與水溶液之間的靜電作用［24］，從而提高了酶解物的蛋白溶解性。

圖4 紫菜酶解物的溶解性Fig.4 The solubility of hydrolysates from Porphyra haitanensis

2.3.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性 對(duì)紫菜酶解物在不同pH條件下的乳化性及乳化穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。不論酶解時(shí)間長(zhǎng)短，在pH3和pH7下，紫菜酶解物的乳化性都相對(duì)較差，而在pH9下乳化性相對(duì)較好(圖5a)。這可能是pH的上升會(huì)使紫菜提取物蛋白中的負(fù)電荷增加［25］，結(jié)果提高了紫菜提取物的乳化性。同時(shí)還可以發(fā)現(xiàn)，相同的pH下，酶解時(shí)間對(duì)紫菜提取物的乳化性影響不顯著。另一方面，在紫菜酶解物的乳化穩(wěn)定性分析結(jié)果(圖5b)顯示，在pH3下乳化穩(wěn)定性隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，經(jīng)過(guò)6h酶解后逐漸穩(wěn)定;在pH7下，乳化穩(wěn)定性幾乎不受酶解時(shí)間的影響;然而在堿性pH條件下，紫菜酶解物的乳化穩(wěn)定性隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在酶解6h時(shí)乳化穩(wěn)定性最好。一般而言，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)，乳化顆粒之間缺乏排斥力，乳化穩(wěn)定性較差。在本研究中紫菜酶解物在pH3以及pH9下的乳化穩(wěn)定性均高于pH7，類似于姚興存［25］等報(bào)道的結(jié)果，進(jìn)一步表明了紫菜酶解提取的蛋白等電點(diǎn)在中性pH附近(圖4)。

圖5 紫菜酶解物的乳化性(a)和乳化穩(wěn)定性(b)Fig.5 The emulsion activity(a)and emulsion stability(b)of hydrolysates from Porphyra haitanensis

3 結(jié)論

利用纖維素酶與木瓜蛋白酶對(duì)壇紫菜進(jìn)行復(fù)合酶解后可以獲得具有一定抗氧化功能的物質(zhì)，經(jīng)酒精浸提后該提取物的抗氧化活性還可以進(jìn)一步得到提高。紫菜酶解物的DPPH自由基清除率與蛋白含量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，而且還發(fā)現(xiàn)利用酒精浸提可以增加抗氧化功能的氨基酸比例，提取物DPPH自由基清除率也隨之提高，表明了紫菜酶解物中的抗氧化活性物質(zhì)可能來(lái)源于紫菜蛋白分解的小分子肽及氨基酸。此外，紫菜酶解物在任一pH下蛋白溶解性都可以接近100%，同時(shí)還具有良好的乳化性及乳化穩(wěn)定性，表明利用復(fù)合酶解、酒精浸提的方法獲得的紫菜酶解物可以作為制備抗氧化功能保健食品的蛋白多肽原料。

［1］農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局，中國(guó)漁業(yè)年鑒［M］.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011:181－186.

［2］張全斌，趙婷婷，綦慧敏，等.紫菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究概況［J］.海洋科學(xué)，2005，29(2):69－72.

［3］王茵，劉淑集，吳成業(yè).紫菜降血壓肽酶法制備工藝的優(yōu)化［J］.福建水產(chǎn)，2008，12(4):64－68.

［4］顧佳雯，張陸曦，徐紅麗，等.條斑紫菜多糖的分離純化和抗腫瘤活性［J］.中國(guó)生物工程雜志，2007，27(7):50－54.

［5］萩野浩志.海苔由來(lái)の健康機(jī)能性成分とその利用［J］.ジャパンフ－ドサイエンス，2007，46(1):44－53.

［6］Sheih IC，Wu TK，F(xiàn)ang TJ.Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from algae protein waste hydrolysate in different oxidation systems［J］.Bioresource Technology，2009，100(13):949－957.

［7］姚興存，蔣棟磊，盤賽昆，等.條斑紫菜蛋白酶解物降血壓活性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(2):62－69.

［8］姚興存，蔣卉，舒留泉，等.條斑紫菜活性肽的抗氧化作用［J］.食品科學(xué)，2011，32(7):104－108.

［9］Yang JI，Liang WS，Chow CJ，et al.Process for the production of tilapiaretorted skin gelatin hydrolysateswith optimized antioxidative properties［J］.Process Biochemistry，2009，44:1152－1157.

［10］鄧成萍，薛文通，孫曉琳，等.不同分子量段大豆多肽功能特性的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(5):109－112.

［11］Chobert JM，Catherine BH，Nicolas MG.Solubility and emulsifying properties of caseins and whey proteins modified enzymatically by trypsin［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1988，36:883－892.

［12］Krasaechol N，Sanguandeekul R，Duangmal K，et al.Structure and functional properties of modified threadfin bream sarcoplasmic protein［J］.Food Chemistry，2008，107:1－10.

［13］蔡春爾，周銘，李春霞，等.條斑紫菜藻膽蛋白提純方法優(yōu)化探索［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009(2):98－102.

［14］沈頌東，戴繼勛，周立冉.條斑紫菜(Porphyra yezoensis)絲狀體的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.海洋通報(bào)，2000，19(3):38－44.

［15］王在貴，韓薇，劉朝良，等.家蠶腸道環(huán)境對(duì)外源纖維素酶活力穩(wěn)定性影響的研究［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2012，21(1):31－35.

［16］Zhang Y，Chen S，Xu M，et al.Characteriztion of thermobifida fusca cutinase Carbohydrate－Binding Module Fusion Proteins and their potential application in bioscouring［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76(20):6870－6876.

［17］Maria IG，F(xiàn)rancisco AT.Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48:4581－4589.

［18］劉青梅，楊性民，鄧紅霞，等.紫菜多糖提取分離及純化技術(shù)研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，31(3):293－297.

［19］Na YS，Kim WJ，Kim SM，et al.Purification，characterization and immunostimulating activity of water－soluble polysccharide isolated from Capsosiphon fulvescens［J］ .International Immunopharmacology，2010，10(3):364－370.

［20］Pihlanto A.Antioxidative peptides drived from milk propeins［J］.Internatinal Dairy Journal，2006，16(11):1306－1314.

［21］張莉莉，嚴(yán)群芳，王恬.大豆生物活性肽的分離及其抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(5):208－210.

［22］Saito K，Jin DH，Ogawa T，et al.Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial.Chemistry［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(12):3668－3674.

［23］Chen HM，Yamauchi F，F(xiàn)ujimoko K，et al.Antioxidative propties of histidine－containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(1):49－53.

［24］劉長(zhǎng)江，曹向宇，劉劍利，等.麥麩多肽的酶法制備及其特性研究［J］.食品工業(yè)，2009，1:34－36.

［25］姚興存，李靜，舒留泉，等.條斑紫菜活性肽的制備及其功能性質(zhì)研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32(12):12－15.