CD62L、MadCAM-1表達與非小細胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系

曹寶森 李 霞 康 劍云 常 茂葉 張 凡 劉 寶生 王新生

成熟淋巴細胞歸巢到特定區(qū)域是穿越高內(nèi)皮微靜脈并進入外周器官的定向遷移，是一個高度調(diào)節(jié)的過程，關(guān)鍵步驟包括貼壁、滾動，粘附、捕獲及遷移。而腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用機制尚不清楚，但與淋巴歸巢有相似之處。CD62L表達上調(diào)在T細胞貼壁滾動過程中發(fā)揮重要作用。黏膜地址素細胞粘附分子(MadCAM-1)是外周淋巴結(jié)血管地址素，與相應(yīng)受體的結(jié)合誘導(dǎo)淋巴細胞的游走和歸巢過程，然而關(guān)于CD62L、Mad-CAM-1在非小細胞肺癌表達研究尚少。筆者通過免疫組化染色分析CD62L、MadCAM-1在非小細胞肺癌、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和正常肺組織、無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達，探討CD62L、MadCAM-1表達與肺癌發(fā)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月至2011年12月河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院、河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院住院的手術(shù)切除后經(jīng)病理診斷為非小細胞肺癌患者60例，其中腺癌20例，鱗癌24例，腺鱗癌10例，大細胞未分化癌6例;肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)30例，無肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)30例，正常肺組織30例。所有患者術(shù)前未經(jīng)化療和放療，無其他惡性腫瘤史。所有標本均經(jīng)病理確診。

1.2 免疫組化染色 一鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德試劑公司，組織石蠟塊包埋，4 μm連續(xù)切片。主要免疫組化步驟:二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，微波爐進行抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗 、三抗各1 h，DAB顯色10～15 min，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷:著色細胞＜10%為陰性，＞10%為陽性。CD62L陽性物質(zhì)定位在腫瘤細胞質(zhì)和細胞膜，MadCAM-1陽性部位定位在高內(nèi)皮微靜脈內(nèi)皮細胞漿和細胞膜。采用HIPAS100圖象分析軟件對所有切片進行圖象分析，首先低倍鏡尋找每張切片著色的典型區(qū)域，每張切片隨機選取10個著色典型區(qū)域且不重復(fù)的視場，放大400倍鏡下測量每個視場中陽性灰度單位，取其均數(shù)即為該切片的著色強度(即灰度單位)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，不同組間表達率的比較采用Fisher精確概率法，各指標在同一組間的表達水平以及與浸潤程度之間作直線回歸相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD62L的表達率情況 CD62L在腫瘤組織中表達在腫瘤細胞、脈管內(nèi)癌栓、間質(zhì)浸潤的淋巴細胞;在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要表達在轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞、脈管內(nèi)癌栓以及淋巴細胞;在正常肺組織以及無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要表達在成熟淋巴細胞;CD62L在癌組織中表達高于正常肺組織(P＜0.05);轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(P＜0.05);CD62L在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達與癌組織中的表達相比無差異(P＞0.05);CD62L在正常肺組織表達與無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達無差異(P＞0.05);CD62L在癌組織中陽性表達率65%(39/60)明顯高于正常肺組織10%(3/30)(P＜0.05);轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達率70%(21/30)明顯高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)陽性表達率17%(5/30)(P＜0.05);CD62L在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達率與癌組織中的表達率相比無差異(P＞0.05);CD62L在正常肺組織表達率與無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達率無差異(P ＞0.05)。

2.2 MadCAM-1的表達率情況 MadCAM-1主要表達淋巴結(jié)濾泡間區(qū)的高內(nèi)皮后微靜脈內(nèi)皮細胞;在癌組織中的高內(nèi)皮微靜脈無表達;轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達率70%(21/30)高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達率40%(12/30)。

2.3 CD62L、MadCAM-1表達水平與肺癌臨床病理特征的關(guān)系CD62L的陽性表達水平(即灰度單位)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、TNM分期之間存在密切相關(guān)，與腫瘤體積、細胞分化程度、侵犯肺膜無關(guān);MadCAM-1的陽性表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、腫瘤體積存在明顯相關(guān)，與細胞分化、侵犯肺膜、腫瘤分期無明顯相關(guān)。見表1。

2.4 CD62L、MadCAM-1表達水平間的相關(guān)分析 CD62L及其受體MadCAM-1表達在肺癌組織以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達之間存在密切相關(guān)(r=0.7081，P=0.002);CD62L及其受體Mad-CAM-1表達在肺癌組織以及無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達之間不存在相關(guān)(P ＞0.05)。

3 討論

腫瘤細胞向遠隔器官的轉(zhuǎn)移是有選擇性而非隨機的，非常類似淋巴細胞的歸巢現(xiàn)象，目前有3種理論來解釋這種歸巢現(xiàn)象:(1)選擇性生長，即腫瘤細胞從血液循環(huán)或者淋巴循環(huán)向組織內(nèi)的滲透是廣泛存在的，但只在具有適合的生長因子和細胞外基質(zhì)的環(huán)境中生存。(2)腫瘤細胞只選擇性地在歸巢器官的內(nèi)皮表面附著生長。(3)腫瘤細胞只向產(chǎn)生特異的水溶性的吸附因子的器官趨化。上述機制在實驗動物的轉(zhuǎn)移觀察中或多或少存在，但目前的實驗證據(jù)還無法完全解釋腫瘤細胞的偏好性轉(zhuǎn)移。

表1 CD62L、MadCAM-1在非小細胞肺癌的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系±s

表1 CD62L、MadCAM-1在非小細胞肺癌的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系±s

注:tc代表CD62L;tM代表MadCAM-1

病理參數(shù) CD62L MadCAM-1 t值 P值臨床分期Ⅰ、Ⅱ期(n=36) 26.3 ±3.4 21.0 ±2.2 t c=4.9921 ＜0.05Ⅲ、Ⅳ期(n=24) 42.3 ±3.5 22.4 ±2.0 t M=2.5406 ＞0.05腫瘤直徑(cm)≤3(n=25) 22.3 ±1.7 23.3 ±1.4 t c=2.8451 ＞0.05＞3(n=35) 22.1 ±3.7 34.3 ±3.0 t M=4.6723 ＜0.05分化程度高分化(n=30) 21.0 ±2.1 25.3 ±4.9 t c=2.2917 ＞0.05中、低分化(n=30) 24.2 ±3.0 23.8 ±2.1 t M=2.3453 ＞0.05有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n=30) 22.2 ±1.3 21.5 ±2.0 t c=5.6632 ＜0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n=30) 40.5 ±2.6 40.4 ±1.6 t M=6.3346 ＜0.05有無浸潤未浸潤肺膜(n=35) 22.2 ±1.7 22.2 ±1.9 t c=1.8042 ＞0.05浸潤肺膜(n=25) 21.5 ±2.5 22.5 ±2.6 t M=2.0216 ＞0.05有無脈管內(nèi)癌栓無脈管內(nèi)癌栓(n=32) 21.7 ±2.6 23.2 ±3.7 t c=4.7802 ＜0.05有脈管內(nèi)癌栓(n=28) 32.4 ±4.9 40.2 ±5.0 t M=5.0216 ＜0.05

淋巴細胞歸巢的關(guān)鍵步驟是貼壁，而CD62L介導(dǎo)的淋巴細胞與內(nèi)皮細胞的初始粘附在此過程中起關(guān)鍵作用。CD62L又稱淋巴細胞歸巢受體(lymphocytehoming receptor，LHR)。由Gallatin和Tedder等首先在小鼠淋巴細胞上發(fā)現(xiàn)，其分子質(zhì)量為140 kD，CD62L分子內(nèi)具有類似凝集素樣的細胞外結(jié)構(gòu)，通過鈣依賴性方式與細胞表面糖蛋白相互作用。CD62L表達于大多數(shù)B細胞和未致敏T細胞以及多數(shù)單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞［1］。CD62L通過識別外周淋巴結(jié)高內(nèi)皮靜脈(HEV)內(nèi)皮細胞表達的外周淋巴結(jié)地址素(peripheral node addressins，PNAd)介導(dǎo)淋巴細胞歸巢到外周淋巴結(jié)。CD62L的正常功能是作為淋巴細胞到達外周淋巴結(jié)的歸巢受體［2］。而Alcaide等用胰島素啟動子調(diào)控猴病毒40T抗原表達的轉(zhuǎn)基因鼠可產(chǎn)生特異向肝臟轉(zhuǎn)移的胰島β細胞瘤，沒有淋巴轉(zhuǎn)移;而在胰島啟動子調(diào)控下同時表達猴病毒40T抗原和L-選擇素的轉(zhuǎn)基因鼠可產(chǎn)生特異性向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰島β細胞瘤，且這種轉(zhuǎn)移能被L-選擇素蛋白的抗體所阻斷［3］，說明L-選擇素可協(xié)助腫瘤細胞發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞表面有CD62L的表達，可協(xié)助腫瘤細胞與淋巴結(jié)黏附，從而可能介導(dǎo)向淋巴道轉(zhuǎn)移。采用單引物擴增法標記的基因芯片技術(shù)篩選乳腺原發(fā)癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)CD62L在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中表達上調(diào)［4，5］。CD62L在腫瘤組織中表達在腫瘤細胞、脈管內(nèi)癌栓、間質(zhì)浸潤的淋巴細胞;在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要表達在轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞、脈管內(nèi)癌栓以及淋巴細胞;在正常肺組織以及無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要表達在成熟淋巴細胞;CD62L在癌組織中表達高于正常肺組織;轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達;CD62L在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達與癌組織中的表達相比無差異;CD62L在正常肺組織表達與無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達無差異;CD62L在癌組織中陽性表達率明顯高于正常肺組織;轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達率明顯高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)陽性表達率;CD62L在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達率與癌組織中的表達率相比無差異;CD62L在正常肺組織表達率與無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達率無差異;相關(guān)分析顯示:CD62L的陽性表達水平(即灰度單位)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、TNM分期之間存在密切相關(guān)，與腫瘤體積、細胞分化程度、侵犯肺膜無關(guān);說明CD62L不僅介導(dǎo)正常肺組織間質(zhì)慢性炎癥中淋巴細胞的歸巢，而且參與肺癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞通過上調(diào)CD62L表達粘附到內(nèi)皮細胞表面，進入脈管系統(tǒng)形成癌栓;同時隨腫瘤臨床分期的增加，血管新生更加明顯，管壁的不完整和低壓力便利腫瘤細胞進入脈管系統(tǒng);同時我們試驗也觀察到表達CD62L的腫瘤細胞分布大多臨近血管豐富區(qū)域，并且脈管內(nèi)癌栓的表達呈現(xiàn)強弱不等現(xiàn)象，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達較強，而腫瘤組織脈管中癌栓表達較弱，推測CD62L的表達水平與其所處的狀態(tài)密切相關(guān)，位于腫瘤組織內(nèi)的癌栓低表達，便利腫瘤細胞脫離初期與內(nèi)皮細胞粘附而進入血流;淋巴結(jié)中的過表達便利腫瘤細胞與HEV的內(nèi)皮細胞粘附游出脈管，完成最終的轉(zhuǎn)移。

MadCAM-1是一種未分類的細胞粘附分子，主要表達在HEV的內(nèi)皮細胞，與相應(yīng)的受體CD62L結(jié)合介導(dǎo)黏膜相關(guān)組織的淋巴細胞的歸巢。有研究發(fā)現(xiàn)炎性腸病患者粘膜下淋巴小結(jié)內(nèi)以及固有層內(nèi)的高內(nèi)皮微靜脈過表達，而敲除Mad-CAM-1基因的小鼠免疫力低下，甚至于胚胎期死亡［6，7］。在大腸癌研究中發(fā)現(xiàn)MadCAM-1的表達降低，而且與腫瘤組織內(nèi)淋巴細胞的浸潤程度密切相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于無下降組，但與脈管內(nèi)癌栓以及新生血管密度無明顯相關(guān)，而且在胃癌研究中未發(fā)現(xiàn)MadCAM-1的下降［8，9］。乳腺癌樣本中研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者同時存在腫瘤周圍高內(nèi)皮微靜脈樣變，而且轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)的HEV內(nèi)皮高表達MadCAM-1，而且脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率明顯高于低表達組［10］。因此推測腫瘤細胞借助Mad-CAM-1的趨化作用，粘附表達相應(yīng)抗體或被表達相應(yīng)抗體免疫細胞包繞的癌栓，在進入脈管系統(tǒng)和穿出脈管系統(tǒng)等環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，完成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。我們的研究顯示MadCAM-1主要表達淋巴結(jié)濾泡間區(qū)的高內(nèi)皮后微靜脈內(nèi)皮細胞;在癌組織中的高內(nèi)皮微靜脈無表達;轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達率高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達率。MadCAM-1的陽性表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、腫瘤體積存在明顯相關(guān)，與細胞分化、侵犯肺膜、腫瘤分期無明顯相關(guān)。說明MadCAM-1在血管內(nèi)皮表達參與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其與表達受體CD62L的腫瘤細胞或被免疫細胞包繞表達CD62L的癌栓結(jié)合，介導(dǎo)脈管內(nèi)的腫瘤細胞粘附到表達地址素的HEV，穿越血管進入淋巴結(jié)，完成轉(zhuǎn)移。同時隨腫瘤體積增加，新生血管增多，進入脈管形成癌栓機會增多，在淋巴結(jié)形成轉(zhuǎn)移灶的機會增加。

CD62L及其受體MadCAM-1表達在肺癌組織以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達之間存在密切相關(guān);CD62L及其受體MadCAM-1表達在肺癌組織以及無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達之間不存在相關(guān)。說明兩者在肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中其協(xié)同作用，可能是腫瘤細胞過表達CD62L的同時，通過某種機制同時上調(diào)HEV內(nèi)皮細胞MadCAM-1的表達，為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移奠定分子基礎(chǔ)，使淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生幾率增加。

1 Carlson MJ，F(xiàn)ulton LM，et al.Coghill JM.L-selectin is dispensable for T regulatory cell function postallogeneic bone marrow transplantation.Am J Transplant，2010，10:2596-2603.

2 Wang Y，Zhang AC，Ni Z，et al.ADAM17 activity and other mechanisms of soluble L-selectin production during death receptor-induced leukocyte apoptosis.J Immunol，2010，184:4447-4454.

3 Alcaide P，Lim YC，F(xiàn)rancis W.Mucin AgC10 from Trypanosoma cruzi Interferes with L-selectin-mediated monocyte adhesion.Infect Immun，2010，78:1260-1268.

4 Buscher K，Riese SB，Shakibaei M，et al.The Transmembrane Domains of L-selectin and CD44 regulate receptor cell surface positioning and leukocyte adhesion under flow.J Biol Chem，2010，285:13490-13497.

5 Leppnen A，Parviainen V，Ahola-Iivarinen E，et al.Human L-selectin preferentially binds synthetic glycosulfopeptides modeled after endoglycan and containing tyrosine sulfate residues and sialyl Lewisx in core 2 Oglycans.Glycobiology，2010，20:1170-1185.

6 Liaskou E，Karikoski M，Reynolds GM，et al.Regulation of mucosal adelressin cell adhesion molecule 1 expression in human and mice by vascular adhesion protein 1 amine oxidase aetivity.Hepatology，2011，53:661-672.

7 Hoshino H，Kobayashi M，Mitoma J，et al.An Integrin α4β7·IgG heterodimeric chimera binds to MadCAM-1 on high endothelial venules in gut-associated lymphoid tissue.J Histochem Cytochem，2011，59:572-583.

8 Xu B，Cook RE，Michie SA.Alpha4beata7 integrin/MadCAM-1 adhesion pathway is crucial for B cell migration into pancreatic lymph nodes in nonobese diabetic mice.J Autoimmun，2010，35:124-129.

9 Allavena R，Noy S，Andrews M，et al.CNS Elevation of vascular and not mucosal addressin cell adhesion molecules in patients with multiple sclerosis.Am J Pathol，2010，176:556-562.

10 Lan J，Heneghan AF，Sano Y，et al.Parenteral nutrition impairs lymphotoxin β receptor signaling via NF-κB.Ann Surg，2011，253:996-1003.