能力驗證樣品中沙門氏菌的分離與鑒定

游勇來 趙瓊 陳志耿

(從化出入境檢驗檢疫局 廣東從化 510900)

1 前言

沙門氏菌(Salmonella sp.)是一群形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造類似的革蘭氏陰性桿菌，屬于需氧或兼性厭氧菌，種類繁多，廣泛分布于自然界，很容易在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接的途徑傳播，沒有中間宿主，能引起人和動物傷寒、副傷寒和食物中毒，臨床表現(xiàn)為急性腸胃炎癥，有突發(fā)性劇烈頭痛、腹瀉、嘔吐、感覺不適和體溫升高等［1］。世界上，每年由沙門氏菌引起的食物中毒病例多達幾千萬;在我國，由沙門氏菌引起的食物中毒占首位，而且由其引起的動物感染也十分嚴(yán)重，已引起各界學(xué)者的廣泛重視［2］。

為了加強實驗室的能力建設(shè)，提高對致病菌的檢測水平，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，2012年我局綜合實驗室參加了由CNAS組織的牛肉中沙門氏菌的能力驗證測試，現(xiàn)將參加本次能力驗證測試中沙門氏菌的分離與鑒定過程及結(jié)果進行總結(jié)報告如下。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

能力驗證樣品：編號分別為 093、139、195，由CNAS組織方提供。樣品為混合菌凍干粉末，采用西林瓶真空密閉包裝。

2.1.2 培養(yǎng)基和試劑

緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、平板計數(shù)瓊脂(PCA)、氧化酶試紙等：購自北京路橋技術(shù)有限公司，均在有效期內(nèi);API 20E試劑條：批號1001118400，用編號為CMCC50115的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株驗證結(jié)果相符，法國生物梅里埃生產(chǎn);沙門氏菌屬多價診斷血清(A－F群)：批號20111020，無污染，用沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株驗證結(jié)果相符，寧波天潤生產(chǎn);沙門氏菌診斷血清：共59種，批號20111124，無污染，用沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株驗證結(jié)果相符，蘭州生物制品研究所生產(chǎn)。

2.1.3 主要儀器設(shè)備

生物梅里埃微生物分析系統(tǒng)，二級生物安全柜，恒溫培養(yǎng)箱，生物顯微鏡，恒溫水浴鍋，渦旋振蕩器。

2.2 方法［3］［4］

2.2.1 樣品處理

按照組織方提供的《參試指導(dǎo)書》，以無菌操作將樣品用滅菌的生理鹽水進行再水化(即溶解)定容至25mL，此液體即為測試樣品(原液)，測試前充分混勻樣品。

2.2.2 增菌

2.2.2.1 前增菌

將原液加入盛有225mL帶玻璃珠(直徑3－4mm，約50粒)的無菌BPW的三角瓶中，充分振蕩混勻，放入36±1℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)18h，前增菌培養(yǎng)情況見表1。

表1 前增菌培養(yǎng)情況

2.2.2.2 選擇性增菌

輕輕搖動培養(yǎng)過的前增菌液，分別無菌移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mL TTB增菌液和10mL SC增菌液進行培養(yǎng)，選擇性增菌培養(yǎng)情況見表2。

表2 選擇性增菌培養(yǎng)情況

2.2.3 分離培養(yǎng)

將2.2.2.2培養(yǎng)結(jié)束的增菌液分別搖勻，以無菌操作，用直徑3mm的接種環(huán)挑取增菌液各一環(huán)，分別劃線接種于一個HE瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后觀察各個平板上有無生長典型或可疑沙門氏菌屬的菌落。

2.2.4 生化試驗

將2.2.3得到的可疑沙門氏菌屬分別純化至平板計數(shù)瓊脂(PCA)上，然后進行氧化酶試驗和API 20E生化試驗。

2.2.5 血清學(xué)凝集試驗

將生化試驗結(jié)果符合沙門氏菌屬特性的菌株做血清學(xué)凝集試驗。采用玻片凝集法，在潔凈玻片上滴加一滴A－F群多價O血清，用接種針挑取對應(yīng)三糖鐵瓊脂斜面上的可疑沙門氏菌屬菌落，與多價血清混合均勻，30s內(nèi)觀察凝集反應(yīng)，同時用生理鹽水做對照;接著用各群O抗原因子血清即O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2和 O11對被檢菌逐一進行凝集試驗檢查，再用陽性反應(yīng)群所包含的各個O因子血清確定其O抗原組成，然后再用該菌所屬群的H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。

3 結(jié)果

3.1 分離培養(yǎng)

093號樣品的TTB和SC增菌液在HE瓊脂平板上分離出無色半透明中間有黑心的單菌落，取其中兩株典型菌落分別標(biāo)注為S1、S2，在XLD上分離出黑色的單菌落，取其中兩株典型菌落分別標(biāo)注為S3、S4;139號樣品的TTB和SC增菌液在HE瓊脂平板上分離出無色半透明中間有黑心的單菌落，取其中兩株典型菌落分別標(biāo)注為S5、S6，在XLD上分離出黑色和黃色的單菌落，取其中兩株典型菌落分別標(biāo)注為S7、S8;195號樣品的TTB和SC增菌液在HE瓊脂平板和XLD上均沒有分離到典型或可疑沙門菌落。

3.2 生化試驗

將分離到得可疑沙門氏菌 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8分別接種至平板計數(shù)瓊脂(PCA)進行純培養(yǎng)，做API 20E生化試驗，結(jié)果見表3。

表3 API 20E生化試驗結(jié)果

根據(jù)上述API 20E生化試驗結(jié)果可以看出，S1、S2、S3、S4 為同一株菌，生化譜均為0736000，S5、S6、S7、S8為另一株菌，生化譜均為4504552。上述2株菌分別利用API 20E V4.1軟件查詢鑒定結(jié)果，結(jié)果分別見圖1和圖2。S1、S2、S3、S4為奇異變形桿菌，%id=99.9%，T=1.0(圖1);S5、S6、S7、S8 為沙門氏菌屬，%id=96.6%，T=0.94(圖 2)。

圖1 菌株S1、S2、S3、S4鑒定結(jié)果

圖2 菌株S5、S6、S7、S8鑒定結(jié)果

3.3 氧化酶試驗

挑取平板計數(shù)瓊脂平板上純化后的菌落進行氧化酶試驗，菌株 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 和 S8 的結(jié)果均為陰性。

3.4 血清學(xué)試驗

為了確定分離到的沙門氏菌屬的菌型，取其中一株S5做了血清學(xué)試驗。利用玻片凝集法，菌株S5與A－F多價O血清發(fā)生凝集反應(yīng)，而生理鹽水對照不發(fā)生凝集。通過O抗原因子血清即O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2和 O11逐一對菌株 S5 做凝集試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株S5與O9單因子血清發(fā)生凝集。參考GB 4789.4－2010常見沙門氏菌抗原表，估計該菌株可能屬于沙門氏菌D群。再用D群的H因子血清結(jié)合8種多價H血清檢查第1相和第2相的H抗原，結(jié)果篩查出菌株S5的抗原模式為1，9，12：g，m：［1，7］，確定菌株 S5 為腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)。

3.5 判定

綜合上述鑒定結(jié)果，判定樣品093、195沙門氏菌未檢出;樣品139沙門氏菌檢出，菌型為腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)，與收到CNAS的報告結(jié)果相符，結(jié)果為滿意。

4 討論

(1)由于參試樣品為凍干粉，所以收到樣品后應(yīng)放置冰箱4℃中保存并盡快進行檢測。

(2)由于組織方在樣品發(fā)送前摻雜了多種干擾菌，為了不使目標(biāo)菌漏檢，檢測過程盡量在無菌環(huán)境中無菌操作，防止污染菌進入樣品。同時還要防止操作人員被感染，試驗過程要注意生物安全。

(3)先用緩沖蛋白胨水(BPW)對樣品進行前增菌十分必要，若直接進行選擇性增菌，很可能使受損待測菌株的生物學(xué)特性不能得到完全恢復(fù)，容易造成假陰性結(jié)果。盡量采用多種選擇性平板和同時使用各種選擇性增菌液，同一種選擇性平板劃線分離時盡量多劃，避免某些平板劃線分離效果不好影響單菌落的分離，培養(yǎng)結(jié)束后要仔細(xì)觀察可疑菌落的特征。

(4)在選擇性平板培養(yǎng)基上，有很多菌落與沙門氏菌相似，特別是奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等由于產(chǎn)硫化氫，可在HE瓊脂上形成中心黑色、邊緣光滑整齊的菌落，與沙門氏菌極為相似［5］。

(5)生化鑒定時盡量選擇品質(zhì)好的試劑，對生物學(xué)特性較為穩(wěn)定的腸桿菌科屬菌株進行鑒定時，不僅操作簡便，而且結(jié)果準(zhǔn)確性也比較高。

(6)關(guān)鍵的診斷試劑，如血清、生化鑒定試劑應(yīng)先做質(zhì)控，即用標(biāo)準(zhǔn)菌株做證實試驗，確定無質(zhì)量問題后再使用。

［1］盤寶進，黃利平.熟制加工食品－鵝肝中沙門氏菌分離與鑒定［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22(2)：223 －224.

［2］王章云.腸炎沙門氏菌引起的食物中毒細(xì)菌學(xué)調(diào)查［J］.中國人獸共患病雜志，1999，15(3)：115.

［3］GB 4789.4－2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗：沙門氏菌檢驗［S］.

［4］SN0172－92出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗方法［S］.

［5］趙貴明.食品微生物實驗室工作指南［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005：141 －142.