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    熒光定量PCR方法鑒別牛、羊奶粉

    2013-11-03 10:13:24張卿蔡婧怡禹思宇趙和平朱忠武唐連飛
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

    孟 芳 張卿 蔡婧怡 禹思宇 趙和平 朱忠武 唐連飛

    (湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局 湖南長(zhǎng)沙 410004)

    1 前言

    熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR)是分子生物學(xué)中廣泛運(yùn)用的一種新定量試驗(yàn)技術(shù),是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)施在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)參照物進(jìn)行分析,計(jì)算檢測(cè)樣品模板的初始濃度。目前這項(xiàng)技術(shù)越來(lái)越多地運(yùn)用到食品檢測(cè)之中,例如,用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)食品中的轉(zhuǎn)基因成分[1]和微生物成分等[2],其中部分熒光定量PCR檢測(cè)方法已經(jīng)作為標(biāo)準(zhǔn)推廣于社會(huì)。但是熒光定量PCR技術(shù)在食品檢測(cè)的運(yùn)用過(guò)程中也受到一些限制,主要是因?yàn)楦鞣N食品經(jīng)過(guò)不同程度的深度加工,其中所含有的DNA成分遭到不同程度的破壞,并且在生產(chǎn)過(guò)程中,混入不同的添加劑和佐料,使食品的成分更加復(fù)雜[3,4]。如何提取出高質(zhì)量的DNA成為熒光定量PCR應(yīng)用于食品檢測(cè)的一個(gè)限制因素。

    據(jù)營(yíng)養(yǎng)學(xué)專家介紹,羊奶在國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)界被稱為“奶中之王”,羊奶的脂肪顆粒體積為牛奶的三分之一,更利于人體吸收,并且長(zhǎng)期飲用不會(huì)引起發(fā)胖。羊奶中的維生素及微量元素明顯高于牛奶,美國(guó)、歐洲的部分國(guó)家均把羊奶視為營(yíng)養(yǎng)佳品,歐洲鮮羊奶的售價(jià)是牛奶的7倍。但是現(xiàn)在市面上羊奶原料緊張,部分商販以牛奶摻入羊奶中以降低制造成本。本方法無(wú)需進(jìn)行DNA提取,奶粉經(jīng)核酸釋放劑處理后可直接進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),并采用熒光定量PCR方法來(lái)鑒別牛、羊奶粉。

    2 材料與方法

    2.1 材料

    2.1.1 樣品與試劑

    不同品牌牛、羊奶粉:均從超市購(gòu)買;苯酚、氯仿、異戊醇等試劑:均為分析純;核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?:由圣湘生物提供。

    2.1.2 儀器

    熒光定量PCR擴(kuò)增儀LC480:羅氏公司;臺(tái)式高速離心機(jī)Mikro200:HETTICH公司;微量分光光度計(jì)Nannodrop1000:Thermo公司。

    2.2 方法

    2.2.1 定量PCR反應(yīng)體系

    取10mg奶粉樣品于2ml的Eppordorf管中,加100μL蒸餾水溶解奶粉,取10μL溶解后的液態(tài)奶,再加入10μL核酸釋放劑,吹打混勻5次,等待10min。

    按下列組分配制PCR反應(yīng)液:PCR反應(yīng)液16μL;熱啟動(dòng)酶1μL;兩套引物和探針同時(shí)加入,上下游引物各1μL;探針溶液1μL;經(jīng)核酸釋放劑處理過(guò)的樣本5μL。

    2.2.2 定量PCR反應(yīng)條件

    依據(jù)同源性分析結(jié)果,最終選擇牛羊線粒體DNA的12SrRNA種內(nèi)保守種間特異的區(qū)域作為牛羊特異檢測(cè)的靶序列。依據(jù)靶序列,用Primers軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)牛源成分的實(shí)時(shí)定量引物和探針及檢測(cè)羊源成分實(shí)時(shí)定量引物和探針。牛源性探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記TAMRA淬滅基團(tuán),羊源性探針5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記TAMRA淬滅基團(tuán)。引物和探針由大連寶生物公司合成。引物探針序列及各種參數(shù)[10]見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:95℃ 10sec;95℃ 5sec,60℃30sec 40個(gè)循環(huán)。

    表1 引物及探針序列

    3 結(jié)果與分析

    3.1 定量PCR鑒別牛羊奶粉方法的建立

    在同一反應(yīng)管內(nèi)對(duì)牛、羊的12SrRNA同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增,應(yīng)用多色熒光檢測(cè)技術(shù),對(duì)反應(yīng)液中含有的兩種不同熒光進(jìn)行兩通道同步檢測(cè),實(shí)現(xiàn)多色熒光同步檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)下表2、圖1、圖2。結(jié)果表明羊奶粉中無(wú)牛奶成分,牛奶粉中也無(wú)羊奶成分。檢測(cè)過(guò)程中僅需奶粉5mg,表明該方法所需樣本少、無(wú)需進(jìn)行DNA提取,操作過(guò)程簡(jiǎn)單省時(shí)。

    表2 牛、羊奶粉熒光值及結(jié)果判定

    圖1 羊奶粉中牛源性成分鑒定結(jié)果

    圖2 牛奶粉中羊源性成分鑒定成果

    3.2 定量PCR鑒別牛羊奶粉方法的應(yīng)用

    對(duì)從超市購(gòu)買的6種不同品牌的羊奶粉進(jìn)行鑒別檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖3)FAM通道除陽(yáng)性對(duì)照外,6個(gè)羊奶粉樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,表明這6個(gè)羊奶粉中沒(méi)有摻入牛奶成分。另外6個(gè)羊奶粉HEX通道均出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線(圖4),表明其確為羊奶粉。

    表3 6種品牌羊奶粉熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

    圖3 6種品牌羊奶粉中牛源性成分的鑒定結(jié)果

    圖4 6種品牌羊奶粉中羊源性成分的鑒定

    3.3 羊奶粉中熒光PCR檢測(cè)牛奶粉的敏感性分析

    分別稱取1g羊奶粉和牛奶粉,加入10mL去離子水溶解。同時(shí),將牛奶以不同的比例摻入純牛奶中,提取DNA并進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖5所示,當(dāng)牛奶以 0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20% 的比例(體積)摻入至羊奶中時(shí),均能通過(guò)熒光PCR得到擴(kuò)增(如圖5),且牛奶含量越高CT值越小,表明本法敏感性高。

    圖5 檢測(cè)含不同比例牛奶的羊奶的熒光PCR結(jié)果

    4 討論

    奶食品有牛奶、馬奶、山羊奶等。在歐美國(guó)家羊奶被視為乳品中精品,稱作“貴族奶”,國(guó)際學(xué)界譽(yù)為“奶中之王”。羊奶因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更優(yōu)于牛奶,市場(chǎng)售價(jià)高于奶牛,加上現(xiàn)在市面上羊奶原料緊張,部分商販以牛奶摻入羊奶中以降低制造成本,這嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。

    目前沒(méi)有對(duì)羊奶粉成分摻假檢測(cè)方法的報(bào)道,僅有個(gè)別對(duì)于牛奶成分摻假檢測(cè)方法的報(bào)道:吳茹怡[5]采用化學(xué)方法檢測(cè)牛奶中的豆質(zhì)成分和大米淀粉成分等,但是該方法過(guò)于表觀,且靈敏度不夠;皮付偉等[6]采用近紅外的分析方法來(lái)檢測(cè)牛奶的成分,但是對(duì)牛奶中的羊源性成分檢測(cè)不能判斷。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR方法鑒別奶粉中的牛、羊源性成分,可鑒別羊奶粉的真假。實(shí)驗(yàn)證明,該方法操作簡(jiǎn)單可行,能檢測(cè)到羊奶中摻入的牛奶成分低至0.1%,靈敏度高。

    之前的研究中運(yùn)用以DNA為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法檢測(cè)奶粉中牛羊源性成分的關(guān)鍵在于DNA提取的成功與否。由于不同的奶粉具有各不相同的功能,因此其成分及加工工藝也都各不相同,各個(gè)品種之間的差異性很大,在提取DNA時(shí)要充分考慮到各類成分對(duì)DNA提取數(shù)量和質(zhì)量的影響,同時(shí)也要考慮到加工工藝對(duì) DNA的降解影響[7]。田雨[8]曾從牛乳中的白細(xì)胞中提取牛奶的DNA,但是,該方法需要的樣品多,提取得到的DNA不僅濃度低,且蛋白含量過(guò)高。覃芳芳[9]將酚仿抽提DNA的方法和前處理相結(jié)合得到了一種快速簡(jiǎn)便的從牛奶中提取DNA的方法,但該方法更適用于牛奶中植物成分DNA的提取。以上方法都需要經(jīng)過(guò)DNA提取的過(guò)程,費(fèi)時(shí)費(fèi)力且DNA質(zhì)量和純度并不高,本實(shí)驗(yàn)不需要經(jīng)過(guò)DNA的提取過(guò)程,微量樣本經(jīng)核酸釋放劑裂解后直接可以進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。該方法快速簡(jiǎn)便,且靈敏度高。另外,該方法全過(guò)程僅需1.5h左右,與其他方法相比更快速更適用于推廣。本實(shí)驗(yàn)建立起來(lái)的牛羊奶粉的鑒定方法快速、靈敏,可利用該方法來(lái)鑒別奶粉,打假治劣、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。

    [1]蔡慧農(nóng),劉光明,蘇文金,等.TaqMan探針用于轉(zhuǎn)基因食品的熒光定量 PCR檢測(cè)[J].食品與發(fā)酵工程,2008,29(12):1-6.

    [2]馬兆飛,李潔莉,胡紅琴,等.PCR和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)快速檢測(cè)牛奶樣品中的沙門氏茵[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2008,8(5):132-137.

    [3]邵碧英,張?bào)w銀,楊婕,等.動(dòng)物產(chǎn)品及飼料中牛源和羊源性成分PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2005,35(3):225-229.

    [4]陳沁,徐仙,姚麗萍.牛奶摻豆?jié){和奶粉的PCR檢測(cè)[J].生物技術(shù)通報(bào),2010,5.162 -165.

    [5]吳茹怡.牛奶摻假物檢驗(yàn)方法研究[J].大眾科技,2005(9):91-92.

    [6]皮付偉,王燕嶺,魯超,等.CCD短波近紅外光譜儀測(cè)定牛奶成分的可行性研究[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2006(4):34,36.

    [7]邵碧英,楊婕,張?bào)w銀.動(dòng)物產(chǎn)品的DNA提取方法[J].畜牧與獸醫(yī),2005,37(9):47 -49.

    [8]田雨.從牛奶中分離DNA方法的建立[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2006,3:112 -113.

    [9]覃芳芳,鄧?guó)欌?,郭新東,等.牛奶中植物成分的PCR檢測(cè)方法研究[J].食品科學(xué),2008,29(6):234-236.

    [10]鄭文文.飼料中牛羊源成分熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[D].吉林:吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009,6:13.

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