高效液相色譜法同時分析水稻和稻田中吡嘧磺隆 和苯噻酰草胺的殘留量

楊麗華，龔道新*，羅俊凱，王雅麗，丁春霞

(湖南農業(yè)大學 a. 資源環(huán)境學院；b.農業(yè)環(huán)境保護研究所；c.理學院，湖南 長沙 410128)

吡嘧磺隆(pyrazosulfuro)具有殺草譜廣、用藥量少、環(huán)境污染輕等優(yōu)點，可用于防治狼把草、野慈姑、鴨舌草、異型莎草等一年生和部分多年生雜草，對稗草有一定的抑制作用[1]。苯噻酰草胺( mefenacet)是酰苯胺類稻田高活性殺稗劑，屬于細胞生長和分裂抑制劑，主要用于防除稻田禾本科雜草，對稗草防治有特效[2]。苯噻酰草胺對闊葉草和莎草的防效不夠理想，一般通過與吡嘧磺隆等磺酰脲類除草劑復配擴大殺草譜，延長持效期，且該類除草劑混劑對單一物種的防除效果普遍高于其單劑。將吡嘧磺隆和苯噻酰草胺與肥料(氮、磷、鉀微量元素或有機肥)加工到一起生產出的類似復合肥的集肥田和除草于一體的稻田除草藥肥[3–4]，已經在農業(yè)生產中逐步應用。這種藥肥的應用不可避免地產生農藥殘留問題。目前，日本已制定了稻米中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺單劑的限量(苯噻酰草胺的MRL值為0.05 mg/kg，吡嘧磺隆的含量不能超過0.10 mg/kg)[5]，中國擬制訂關于吡嘧磺隆和苯噻酰草胺在稻米等產品中的限量標準，因此，水稻和稻田中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺殘留檢測方法的建立具有明顯的應用價值。

吡嘧磺隆和苯噻酰草胺殘留量的測定方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[6–10]、氣相色譜法[11–12]和高效液相色譜–質譜聯(lián)用法[13]等。目前，國內外對吡嘧磺隆和苯噻酰草胺復配除草劑及其藥肥的研究主要是針對其除草藥效，其單劑在環(huán)境介質和各種作物中殘留的檢測方法已有報道[14–22]，但其復配除草劑及藥肥在水稻和稻田環(huán)境中殘留量的同時檢測鮮見報道。筆者建立同時測定稻田水、土壤、水稻植株和糙米中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺殘留量的高效液相色譜分析方法，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

2010年6—9月于湖南農業(yè)大學實驗基地(在該基地未使用過含吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的農藥)多點采集水稻植株樣品，切成1 cm長后混勻；于水稻田中多點取耕作層(0～20 cm)土壤樣品，去雜后混勻；按對角線法多點隨機采集稻田水樣品，混合均勻后盛入潔凈的封口塑料瓶中；水稻成熟后用礱谷機將谷殼和糙米分開，取經植物粉碎機粉碎并過0.84 mm篩的糙米樣品。

主要儀器：Agilent Technologies 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，配有紫外檢測器和化學工作站)；THZ-82A型水浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；RE–2000A型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；玻璃層析柱(1.5 cm ×20 cm)。

主要試劑：弗羅里硅土(Florisil，0.15～0.25 mm，國藥集團化學試劑有限公司生產，用前在550 ℃烘3～5 h，冷卻后以2%蒸餾水脫活)；丙酮(長沙湘科精細化工廠)和二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、乙酸(天津市恒興化學試劑制造有限公司)；甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)；無水硫酸鈉、氯化鈉(天津市博迪化工有限公司)等。以上試劑均為A.R.級。

吡嘧磺隆·苯噻酰草胺0.43%顆粒劑、吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的標準品(純度分別為97.3%和90.5%)，均由廣西樂土生物科技有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 吡嘧磺隆和苯噻酰草胺提取條件的確定

1.2.1.1 提取溶劑的選擇和各樣品的提取方法

因稻田水、土壤、糙米和水稻植株中的雜質及色素等不盡相同，故根據吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的溶解特性，分別選用不同的提取劑來提取：稻田水以二氯甲烷作為提取劑；稻田土壤樣品以丙酮、丙酮–乙酸、甲醇–乙酸為提取劑；糙米以甲醇、二氯甲烷、丙酮、丙酮–乙酸為提取劑；水稻植株以丙酮–乙酸乙酯–乙酸、石油醚–二氯甲烷–乙酸、正己烷–乙酸乙酯、二氯甲烷–乙酸和二氯甲烷–乙腈–乙酸為提取劑。

1) 稻田水樣品的提取。準確量取稻田水樣100.0 mL，置于盛有20 mL10%氯化鈉溶液的分液漏斗中，搖勻后分別用30、30、20 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，在旋轉蒸發(fā)儀上45 ℃濃縮近干，用色譜甲醇定容至5.0 mL，過0.45 μm有機系濾膜，供HPLC測定。

2) 稻田土壤樣品的提取。準確稱取稻田土壤樣品20.0 g，置于250 mL三角瓶中，加80 mL甲醇，并加適量乙酸，調節(jié)pH至5～6，在水浴恒溫(25 ℃)振蕩器中振蕩30 min，靜置；用定量濾紙過布氏漏斗減壓抽濾，合并抽濾液并轉入三角瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上45 ℃濃縮近干；用少量二氯甲烷溶解，并轉入盛有20 mL 10%氯化鈉溶液的分液漏斗中，再用30、30、20 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，在旋轉蒸發(fā)儀上45 ℃濃縮近干；用色譜甲醇定容至5.0 mL，過0.45 μm有機系濾膜，供HPLC檢測。

3) 糙米樣品的提取。準確稱取粉碎好的糙米樣品10.0 g，置于250 mL三角瓶中，加80 mL丙酮，并加適量乙酸，調pH至5～6，在水浴恒溫(25 ℃)振蕩器中振蕩30 min。余下提取步驟同稻田土壤樣品的提取方法。

4) 水稻植株樣品的提?。簻蚀_稱取水稻植株樣品10.0 g，置于250 mL三角瓶中，加二氯甲烷和乙腈的混合液(體積比1∶1)80 mL，并加適量乙酸，調pH至5～6，在水浴恒溫(25 ℃)振蕩器中振蕩30 min，靜置；布氏漏斗減壓抽濾，合并抽濾液，轉入三角瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上45 ℃濃縮近干。濃縮液過弗羅里硅土柱凈化：先用20 mL二氯甲烷和甲醇的混合液(體積比1∶1)預淋，將濃縮液移入弗羅里硅土凈化柱中，用70 mL二氯甲烷和甲醇的混合液(體積比1∶1)淋洗(每次10 mL左右)，收集淋出液，于旋轉蒸發(fā)器上45 ℃濃縮近干，用色譜甲醇定容至5.0 mL，過0.45 μm有機系濾膜，供HPLC檢測。

1.2.1.2 柱凈化洗脫條件的確定

分別以丙酮、丙酮–乙酸乙酯(體積比1∶1)、甲醇和甲醇–二氯甲烷(體積比1∶1)作為洗脫劑對Flosisil凈化柱進行洗脫。

1.2.1.3 弗羅里硅土柱凈化淋洗體積的確定

取10 mg/L吡嘧磺隆和苯噻酰草胺混合標準溶液1 mL入弗羅里硅土柱中，用100 mL甲醇–二氯甲烷(體積比1∶1)淋洗，以10 mL為單位，分10次收集淋洗液，濃縮后用色譜甲醇定容，供HPLC檢測。

1.2.2 HPLC 檢測條件的確定

1.2.2.1 檢測波長的選擇

將吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的混合標準溶液10 mg/L 進行HPLC 檢測，以穩(wěn)定的流動相為空白值，在吡嘧磺隆和苯噻酰草胺標準品峰最高時，利用紫外可變波長檢測器在波長190～340 nm 進行光譜掃描，根據其最大吸收波長，確定HPLC 檢測波長。

1.2.2.2 流動相的選擇

以不同體積比的甲醇–水為流動相時，吡嘧磺隆存在拖尾現(xiàn)象，且峰型較寬，這可能是由于吡嘧磺隆分子中堿性基團在色譜柱吸附產生的，為此，在流動相中加入乙酸來改善峰型。以保留時間和分離效果為定性指標，以峰面積為定量指標分別考察不同體積比的乙酸、水、甲醇(2.5∶22.5∶75.0、3.0∶27∶70、3.5∶31.5∶65.0 和4.0∶36.0∶60.0)對目標化合物的分離效果。

1.2.3 標準曲線的繪制及檢出限

采用梯度稀釋法，用色譜甲醇將吡嘧磺隆和苯噻酰草胺分別配制成質量濃度0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/L的混合標準工作溶液，在選定的色譜條件下測定各濃度標準工作溶液所對應色譜峰的峰面積。以標準工作溶液的質量濃度(X)與其對應的色譜峰的峰面積(Y)繪制標準工作曲線，得出回歸方程、相關系數和線性范圍。根據3倍信噪比計算吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的檢出限。

1.2.4 回收率和精密度試驗

在稻田水、土壤、水稻植株和糙米的空白對照樣品中分別添加吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的混合標準工作溶液，使其質量分數分別為0.05、0.10、1.00 mg/kg，每個處理重復5 次。按上述選定方法進行提取、凈化和檢測，計算回收率和相對標準偏差。

1.2.5 對所建立的前處理方法和HPLC 法的驗證

根據中國農業(yè)部農藥殘留田間試驗準則[23]，在湖南農業(yè)大學實驗基地的水稻田邊選取一塊沒有種植水稻的稻田(灌水深3～5 cm)，采用直接撒施法施入吡嘧磺隆·苯噻酰草胺0.43%顆粒劑270 kg/hm2(有效成分為1 161.0 g/hm2，其中吡嘧磺隆為43.2 g/hm2，苯噻酰草胺為1117.8 g/hm2)，分別在施藥后2 h 和1、3、5、7、10、14、21、28、35、42 d 采集稻田土壤(取樣深度為0～10 cm)和稻田水樣品。試驗重復3 次。

采用直接撒施法，分別按吡嘧磺隆·苯噻酰草胺0.43%顆粒劑180、270 kg/hm2施入移栽后5～7 d的水稻移栽田或拋秧后5～7 d 的水稻拋秧田或1.5～2.0 葉期的水稻直播田，施藥1 次。試驗重復3次。在水稻的正常收獲期分別采集水稻植株(包括稻稈和稻谷)。

按選定的吡嘧磺隆及苯噻酰草胺的提取和檢測條件，測定吡嘧磺隆·苯噻酰草胺0.43%顆粒劑稻田水、稻田土壤、水稻植株和糙米樣品，其中5 份以添加標準樣品的方式(0.50 和1.00 mg/kg 的加標水平) 用于過程控制。重復3 次，計算樣品中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的殘留量。

2 結果與分析

2.1 HPLC 檢測方法和樣品前處理方法的建立

2.1.1 吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的適宜提取劑

試驗結果表明：

1) 以二氯甲烷為稻田水樣品提取劑時，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的回收率均在86%以上，而且兩者分離較好，故選用二氯甲烷作為稻田水樣品的提取劑。

2) 稻田土壤樣品以丙酮為提取劑時有雜質峰干擾，基線高且不穩(wěn)定；以丙酮–乙酸為提取劑時添加回收率較低(50%以下)；以甲醇–乙酸為提取劑時干擾雜質少，分離效果較好，添加回收率都在80%以上，故選用甲醇–乙酸作為稻田土壤樣品的提取劑。

3) 糙米樣品以甲醇、二氯甲烷為提取劑時均有雜質峰干擾；以丙酮、丙酮–乙酸為提取劑時的添加回收率均達80%以上，且以丙酮–乙酸為提取液時吡嘧磺隆更易進入有機相，添加回收率也相對較高，而對苯噻酰草胺的回收率無影響，所以，選用丙酮–乙酸作為糙米樣品的提取劑。

4) 水稻植株樣品以丙酮–乙酸乙酯–乙酸、石油醚–二氯甲烷–乙酸為提取劑時提取雜質多，基線不平，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的峰型也不好，其添加回收率也不達標；以正己烷–乙酸乙酯為提取劑時也有雜質干擾；以二氯甲烷–乙酸為提取劑時，添加回收率較低(50%)；以二氯甲烷–乙腈–乙酸為提取劑時，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的添加回收率均達到了農藥殘留量分析與檢測的技術要求，峰形好、對稱，與雜質的分離效果也好，故選取二氯甲烷–乙腈–乙酸作為水稻植株的提取劑。

2.1.2 柱凈化最佳淋洗條件

水稻植株樣品分別以丙酮、丙酮–乙酸乙酯為洗脫劑時，苯噻酰草胺的回收率達101.66%，而吡嘧磺隆無法洗脫，其添加回收率也不達標。以甲醇為洗脫劑時，苯噻酰草胺的回收率達85.60%，而吡嘧磺隆的回收率偏低(70.64%)。以甲醇–二氯甲烷為洗脫劑時，苯噻酰草胺和吡嘧磺隆的回收率分別為96.01%和95.27%，吡嘧磺隆淋洗7 次的回收率分別為11.9%、48.6%、15.6%、9.6%、6.2%、3.4%和0%，前60 mL 的總淋洗回收率達96.01%；苯噻酰草胺淋洗7 次的回收率分別為16.1%、50.4%、14.0%、6.3%、5.3%、4.0%和0%，前60 mL 的總淋洗回收率達95.27%，且洗脫下來的雜質較少，不干擾目標化合物的測定，因此，選用甲醇–二氯甲烷溶合液(體積比1∶1)作為水稻植株樣品的淋洗劑，用量為60 mL。

2.1.3 HPLC 法同時分析吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的波長和流動相

紫外光譜圖顯示，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的最大紫外吸收波長分別為240、219 nm。比較波長220、230、240、250 nm 的檢測結果，發(fā)現(xiàn)波長為240 nm時既能兼顧吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的測定靈敏度和穩(wěn)定性，也能使雜質干擾較少，故選取240 nm 作為測定波長。

流動相中甲醇的比例越大，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的峰型對稱越好，但甲醇比例過大時，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的分離不好；甲醇比例過小時，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的峰型變寬。優(yōu)化試驗結果表明，甲醇、水、乙酸混合(體積比70.0∶29.7∶0.3)時，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的分離效果較好，它不僅能使吡嘧磺隆和苯噻酰草胺及稻田中的雜質有效分離，而且峰形對稱，靈敏度高，保留時間適當，能有效避免基質中相關物質的干擾，故選取甲醇、水、乙酸的混合液(體積比70.0∶29.7∶0.30)作為流動相。

綜上所述，高效液相色譜法同時分析吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的條件：流動相為甲醇、水、乙酸的混合液(體積比70.0∶29.7∶0.3)，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長240 nm，進樣量20 μL，C18不銹鋼柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。此條件下吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的標準色譜圖見圖1。圖1 結果表明，吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的分離效果較好，且峰形對稱，靈敏度高，保留時間適當。

圖1 苯噻酰草胺和吡嘧磺隆標準溶液的分離色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mefenacet and pyrazosulfuro in standard solution

2.1.4 線性關系及檢出限

在上述選定的HPLC條件下，混合標準工作液中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的質量濃度為0.01～1.00 mg/L時，質量濃度與其峰面積呈良好的線性關系。吡嘧磺隆的線性回歸方程為y =115.13x+0.671，R2=0.999 7；苯噻酰草胺的線性回歸方程為y=151.96x– 0.444，R2=0.999 8。吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的檢出限均為0.01 mg/L。

2.1.5 方法的精密度和回收率

由表1可見，在加標質量濃度為0.05～1.00 mg/kg時，稻田水、土壤、水稻植株和糙米中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的平均添加回收率分別為86.32%～104.07%、84.00%～98.53%、88.36%～95.37%和88.69%～ 95.00%；它們的相對標準偏差都小于或等于8.55%，符合中國農藥殘留量分析與檢測的技術要求。

表1 吡嘧磺隆和苯噻酰草胺在稻田水、稻田土壤、水稻植株和糙米中的添加回收率Table 1 Recoveries results of pyrazosulfuro and mefenacet in water,soil,plant and unpolished rice

2.2 樣品中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的檢測結果

驗證結果表明，稻米樣品中均無吡嘧磺隆和苯噻酰草胺檢出，而其他樣品中均有吡嘧磺隆和苯噻酰草胺檢出。質量控制樣品的測定結果穩(wěn)定、可靠，其吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的回收率為87.5%～103.5%，相對標準偏差為3.2%～8.3%。圖2結果表明，加標樣品的HPLC色譜峰均有足夠的信噪比，且峰形良好，其中空白樣品的背景干擾小，不影響實際樣品中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的定量分析。

圖2 稻田水、土壤、水稻植株和糙米樣品中苯噻酰草胺和吡嘧磺隆檢測的色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mefenacet and pyrazosulfuro in water,soil,plant and unpolished rice

3 結 論

采用高效液相色譜法同時測定稻田水、稻田土壤、水稻植株和糙米中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的殘留量。稻田水樣品用二氯甲烷直接萃?。坏咎锿寥篮筒诿讟悠贩謩e用酸性甲醇和丙酮提取，再用二氯甲烷萃取凈化；水稻植株樣品用酸性二氯甲烷和乙腈的混合液(體積比1∶1)提取，再經弗羅里硅土柱凈化。采用C18不銹鋼柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)分離，以甲醇、水、乙酸的混合液(體積比70.0∶29.7∶0.3)為流動相，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，在240 nm下檢測。該方法簡單快速，不受樣品中其他組分的干擾，能準確有效地同時測定水稻和稻田中吡嘧磺隆和苯噻酰草胺的殘留量，對實際樣品的檢測結果符合農藥殘留量分析與檢測技術要求，具有一定的推廣價值。

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