氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香菇中幾種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量

韓 梅，侯 雪

（四川省農(nóng)科院測(cè)試中心，四川 成都 610066）

0 引 言

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一種高效、廣譜型殺蟲劑，母體結(jié)構(gòu)為含氮合成的氨基甲酸酯衍生物，能抑制昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶，阻斷正常的神經(jīng)傳導(dǎo)，使昆蟲中毒死亡[1]。氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)食品安全和生態(tài)環(huán)境存在潛在威脅，許多國(guó)家和地區(qū)對(duì)這類農(nóng)藥殘留規(guī)定了嚴(yán)格的限量。

目前，氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測(cè)定方法有很多[1]，主要有氣相色譜法（GC）[2-3]、液相色譜法（LC）[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[5-6]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS）[7-8]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[9]等?，F(xiàn)在一般的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法多為氣相色譜法、液相色譜法，靈敏度較低，且陽(yáng)性確證困難，尤其是對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的樣品，不能準(zhǔn)確定性、定量。

本方法以食用菌中常規(guī)氣相色譜法分析中基質(zhì)干擾最大的香菇為研究對(duì)象。香菇是世界第二大食用菌，也是我國(guó)特產(chǎn)之一，在民間素有“山珍”之稱。香菇在生長(zhǎng)、儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中，為了防治病蟲害，難免會(huì)使用化學(xué)防治方法，為了保證食品安全，需監(jiān)測(cè)其農(nóng)藥的殘留情況。本文采用體積排阻色譜-凝膠滲透色譜（GPC）法對(duì)樣品進(jìn)行凈化，以除去香菇中氨基酸、多糖類等大分子物質(zhì)，然后采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)抗蚜威等6種具有代表性的氨基甲酸酯農(nóng)藥進(jìn)行測(cè)定，建立了香菇中6種氨基甲酸酯農(nóng)藥的GPC凈化及GC-MS/MS的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:Varian 450 GC-320 MS/MS（美國(guó)Varian公司）；德國(guó)IKA高速勻漿機(jī)；渦旋混勻器；凝膠滲透色譜儀（美國(guó)J2 Scientific），配有內(nèi)充Bio-Beads S-X3玻璃柱（內(nèi)充凝膠22g，20cm×2cm）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士 Büchi）。

丙酮、乙腈均為色譜純；乙酸乙酯、環(huán)己烷為分析純；去離子水；氯化鈉為分析純；克百威等6種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于北京中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)開(kāi)發(fā)公司標(biāo)樣開(kāi)發(fā)部，均為100mg/L。

氨基甲酸酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取100mg/L單一標(biāo)液各1mL，置于50mL容量瓶中，用丙酮稀釋定容至刻度，此混合儲(chǔ)備液濃度為2.0mg/L。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用正己烷-丙酮（9∶1）稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

樣品來(lái)源：市場(chǎng)上的抽檢樣。

1.2 樣品制備

（1）提取凈化。準(zhǔn)確稱取25.0g粉粹試樣放入勻漿機(jī)中，加入50.0mL乙腈，在勻漿機(jī)中高速勻漿2min后，用濾紙過(guò)濾或抽濾，濾液收集到裝有5～7 g氯化鈉的100mL具塞比色管或具塞量筒中，收集濾液40～50 mL，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，在室溫下靜置60 min，使乙腈相和水相分層。

（2）濃縮。吸取10.00mL（相當(dāng)于5g樣品）乙腈溶液，在40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，準(zhǔn)確加入乙酸乙酯+環(huán)己烷（1∶1）10.0mL 的混合溶劑溶解殘?jiān)?，?0.45μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后移入10mL樣品瓶中，供凝膠凈化。

（3）GPC凈化。流動(dòng)相為環(huán)己烷+乙酸乙酯（1∶1），流速為4.7 mL/min，進(jìn)樣量為5.0 mL，收集8～20 min流出的組分于旋蒸瓶中，40℃蒸發(fā)至近干，用正己烷-丙酮（9∶1）準(zhǔn)確定容到 2.5mL，供質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列制備方法

分別吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.0mg/L）于 10 mL容量瓶中，用正己烷-丙酮（9∶1）稀釋定容至刻度，配成 0.010，0.040，0.100，0.200，0.500mg/L等一系列的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4 農(nóng)藥色譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為VF-5MS（30m×0.25mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口（1079）溫度：60℃保持 1.0 min，以200℃/min升到250℃，保持10min再以200℃/min降到60℃；PTV進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：5.0μL。柱溫：50℃保持3 min，以25℃/min升至150℃，不保持，再以10℃/min升溫至260℃ 保持2min。載氣:高純氦氣（99.999%），恒流1.2mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI）；電子轟擊能：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸溫度：280℃，溶劑延遲：7 min。碰撞氣(氬氣)為 1.5 mTorr。各組分的保留時(shí)間、母離子、特征碎片離子、碰撞電壓、駐留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 6種氨基甲酸酯農(nóng)藥的分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

本法前處理提取方法參照標(biāo)準(zhǔn)方法NY/T 761-2008[4]。實(shí)驗(yàn)表明，乙腈在提取農(nóng)殘方面比乙酸乙酯更具有優(yōu)勢(shì)[9]：（1）乙腈的飽和蒸氣壓較乙酸乙酯更低，因此揮發(fā)性更小一些；（2）使用乙腈能保證較高的提取效率，能提取的農(nóng)殘種類范圍更廣；（3）較之丙酮、乙酸乙酯等萃取溶劑，用乙腈萃取，共萃物更少，在提取這一步就減少了部分干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈提取。

2.2 凈化方法的選擇與優(yōu)化

香菇中含有豐富氨基酸、蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分，在氣相色譜測(cè)定中會(huì)產(chǎn)生大量的干擾成分，采用柱層析等凈化方法也不能有效地將干擾雜質(zhì)除去，同時(shí)農(nóng)藥成分有可能損失，且操作步驟繁雜。但是選用中性、多孔的Bio-Beads SX-3作為GPC柱填料，使用自動(dòng)化GPC系統(tǒng)不僅能進(jìn)行有效地分離凈化，而且還大大節(jié)約了時(shí)間和溶劑[11]。本實(shí)驗(yàn)選用體積比為1∶1的乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相，流速為4.7mL/min，按1.2（3）方法分時(shí)間段收集樣品，分別檢測(cè)各段流出液中組分的含量，發(fā)現(xiàn)8min以前的收集液中未檢出農(nóng)藥，三羥基克百威在8min就開(kāi)始流出，其他的農(nóng)藥在9min后開(kāi)始流出，18min以后的收集液中未檢出農(nóng)藥?？紤]到凝膠色譜柱有可能有拖尾情況出現(xiàn)，于是在農(nóng)藥流出的時(shí)間段后多收集2 min；因此，最后確定樣品過(guò)凝膠柱凈化的收集時(shí)間為第8～20min，共收集13min流出液。

2.3 GC-MS/MS方法的建立

香菇基質(zhì)成分比較復(fù)雜，含有大量的易揮發(fā)性物質(zhì)，即使是經(jīng)過(guò)凈化后的樣品，應(yīng)用氣相色譜和單級(jí)質(zhì)譜法分析時(shí)，都會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的干擾現(xiàn)象，所以要進(jìn)行準(zhǔn)確地定性定量需結(jié)合高選擇性的MS/MS技術(shù)，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。為此，需要對(duì)待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥的色譜條件進(jìn)行一系列參數(shù)設(shè)置和優(yōu)化，選擇合適的特征離子。本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)色譜分離來(lái)確定6種農(nóng)藥組分的保留時(shí)間。比如確定了速滅威保留時(shí)間為9.41min，然后通過(guò)對(duì)6種農(nóng)藥組分進(jìn)行單級(jí)質(zhì)譜掃描來(lái)確定每種農(nóng)藥組分的主要碎片離子，一般是選擇分子離子或相對(duì)豐度較大、高質(zhì)量端的一級(jí)碎片離子，且能產(chǎn)生較強(qiáng)響應(yīng)的子離子的碎片離子作為母離子[12]，其他響應(yīng)較強(qiáng)的碎片離子作為子離子。比如速滅威的分子離子為165（m/z），選它作為母離子，其他響應(yīng)較強(qiáng)的離子有108（m/z）、107（m/z）可作為子離子，然后應(yīng)用子離子掃描模式（MS/MS）分別對(duì)選定的母離子進(jìn)行二次轟擊，獲得其子離子譜圖，組成多反應(yīng)監(jiān)測(cè)通道。最后分別在不同的碰撞能量（5～50V）下對(duì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，選擇能使監(jiān)測(cè)到的子離子產(chǎn)生最強(qiáng)響應(yīng)的碰撞能量作為最終碰撞能量，從而得到優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 方法的線性關(guān)系和檢出限

稱取不含農(nóng)藥的香菇空白樣品，采用上述的提取凈化條件，經(jīng)GPC凈化后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用正己烷-丙酮（9∶1）定容，配成了基質(zhì)空白溶液。按1.3的方法，將2.0 mg/L的6種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.010，0.040，0.100，0.200，0.500 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4色譜分析條件對(duì)上述一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與空白樣品進(jìn)行測(cè)定，以各氨基甲酸酯組分的峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以每種農(nóng)藥最低質(zhì)量濃度點(diǎn)定量離子的響應(yīng)值與空白樣品中噪聲響應(yīng)的3倍外推法計(jì)算檢出限（LOD），方法的線性關(guān)系、檢出限結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中的數(shù)據(jù)看出，在10～500μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，該方法的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；6種農(nóng)藥目標(biāo)物的檢出限為0.046～6.4 μg/kg，可以滿足定量分析的要求。

2.5 加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

向空白樣品定量添加上述6種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度分別為 20，40，100 μg/kg，添加后按照“1.2”節(jié)所述步驟進(jìn)行提取、濃縮、凈化和測(cè)定，用優(yōu)化后的EI-MS/MS參數(shù)平行分析5次，加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表2。加標(biāo)回收譜圖及空白譜圖見(jiàn)圖1和圖2。從表2可以看出，添加水平為20，40，100μg/kg時(shí)，6種目標(biāo)物在樣品中的平均回收率為84.0%～123.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=5）為 0.30%～7.7%，不大于15%，符合痕量殘留分析。從空白與樣品總離子流圖（圖1與圖2）來(lái)看，雖然有雜峰，但比氣相色譜干擾小的多，不干擾目標(biāo)離子，所以采用母離子與子離子的GC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式可以增強(qiáng)定性結(jié)果的可靠性，且由于本底值大大降低，定量時(shí)檢測(cè)的靈敏度可以得到較大的提高。采用本方法所得到的基質(zhì)譜圖中雜質(zhì)峰少，對(duì)6種農(nóng)藥目標(biāo)物均無(wú)明顯干擾現(xiàn)象，從而在根本上解決了基質(zhì)成分非常復(fù)雜的香菇中農(nóng)殘檢測(cè)工作易出現(xiàn)的干擾問(wèn)題。

表2 6種氨基甲酸酯的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、方法檢出限（LOD）、平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

圖1 空白香菇樣品的總離子流圖

圖2 香菇空白樣品加標(biāo)回收的總離子流圖

3 結(jié)束語(yǔ)

本文建立了乙腈提取、凝膠滲透色譜凈化、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)香菇樣品中6種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的方法，較好地排除了香菇樣品中基質(zhì)的干擾，減少了本底值，降低了方法檢出限。此外，前處理方法省時(shí)省力，且自動(dòng)化程度較高，提取效率也比較滿意，凈化的溶劑毒性較小，在過(guò)小柱時(shí)避免使用毒性大的甲苯、二氯甲烷等洗脫溶劑。本方法可應(yīng)用于食用菌中基質(zhì)干擾大的香菇類樣品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速、簡(jiǎn)便定性定量分析。

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