桑葉HILIC特征指紋圖譜研究

東莎莎，趙恒強，王 曉，崔清華，耿巖玲，劉代成，劉建華，王小如

(1．山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250014;2．山東省科學(xué)院 中藥過程控制研究中心，山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014;3．國家海洋局第一海洋研究所，青島市現(xiàn)代分析技術(shù)及中藥標準化重點實驗室，山東 青島 266061;4．山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355)

桑葉為桑屬植物桑樹(Morus alba L．)的樹葉，據(jù)《中藥志》記載，桑葉具有“清風(fēng)散熱、清肺潤燥、涼血明目”等功效［1］?，F(xiàn)代研究表明，桑葉中含有多種活性物質(zhì)，如黃酮類、生物堿、有機酸、氨基酸、揮發(fā)油、三萜類等化合物，具有降血糖、降血壓、降低膽固醇、抗衰老、提高免疫力、抗菌、抗病毒、防癌等多種生理功能［2］。目前，國際國內(nèi)市場對桑葉藥材的需求越來越大［3］，桑葉功能活性成分在食品、醫(yī)藥、保健品中的應(yīng)用范圍也越來越廣［4］。然而不同產(chǎn)區(qū)桑葉的品質(zhì)差別顯著［5］，嚴重影響了桑葉藥材的開發(fā)利用和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性。因此，開展桑葉藥材的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別方法研究，對控制桑葉藥材質(zhì)量，保障桑葉藥材合理開發(fā)利用具有重要意義。

指紋圖譜技術(shù)已成為國際上公認的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效手段［6］。色譜指紋圖譜有很強的分離效能，且能夠與多種檢測器聯(lián)用，可實現(xiàn)各種波譜信息的定性及定量分析［7］，現(xiàn)已普遍應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制。桑葉藥材所含化學(xué)成分種類多，極性差異大。根據(jù)不同種類化學(xué)成分的特點發(fā)展與之適應(yīng)的分析方法，對有效表征桑葉化學(xué)成分，全面控制其質(zhì)量具有重要意義。目前已發(fā)展了多種針對桑葉藥材的指紋圖譜方法，主要有高效液相色譜法(HPLC)［8－9］、氣相色譜 －質(zhì)譜法(GCMS)［10］、高效毛細管電泳法(HPCE)［11］等。另外，在2010版《中國藥典》中也采用反相高效液相色譜法(RP－HPLC)對桑葉有效成分進行分析［12］。但HPLC法主要針對中等極性成分，GC－MS法主要針對弱極性和揮發(fā)性成分。HPCE法雖然較適用于中等極性和強極性化學(xué)成分的分析，但其靈敏度低、重復(fù)性差、與質(zhì)譜聯(lián)用復(fù)雜等缺點，限制了其應(yīng)用。

親水色譜法(HILIC)是20世紀90年代新發(fā)展起來的一種色譜分離技術(shù)，它采用強極性材料作為固定相，特別適合強極性和親水性化合物的保留和分離［13］。另外，其采用高比例的乙腈－水作為流動相，與質(zhì)譜聯(lián)用可使目標化合物更易離子化、信號較強。相反，用RP－HPLC分離強極性和親水性化合物時，流動相中因需要有高比例的水，而影響色譜柱使用壽命;另外，高比例的水會影響化合物在電噴霧離子源中的離子化效率，不利于質(zhì)譜鑒別。由此可見，HILIC相比RP－HPLC更適合親水性化合物的分析測定。目前，HILIC法在中草藥和天然藥物中極性成分的分析研究中已有應(yīng)用［14－15］，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但在桑葉藥材強極性成分的分析和質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用未見報道。本文首次開展桑葉藥材的HILIC特征指紋圖譜研究，為全面、有效地控制桑葉藥材的質(zhì)量和真?zhèn)舞b別提供方法和技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

安捷倫1200高效液相色譜儀(自動進樣器、在線脫氣機、梯度泵、恒溫箱、二極管陣列檢測器);G6520A型飛行時間質(zhì)譜儀，配有ESI離子源(美國Agilent公司);萬分之一電子分析天平(Mettcer AE240)、指紋圖譜相似度評價軟件為“中藥色譜指紋相似度評價系統(tǒng)”(中國藥典委員會2004A);KQ2400 KDE型高功率數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);Buchi型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific)，甲醇(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)，甲酸、甲酸銨(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為分析純，實驗用水為Milli-Q超純水(18 MΩ)。12批不同產(chǎn)地的桑葉樣品購于濟南市各大藥店，樣品信息見表1。

表1 桑葉樣品來源Table 1 Samples used in the works

1.2 供試品溶液的制備

桑葉藥材粉碎，過20～40目篩，精密稱取桑葉粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%甲醇，超聲提取20 min，重復(fù)提取1次，將濾液過濾后合并，于55℃下旋蒸至干，用90%的乙腈重新溶解提取物并定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜后作為供試品溶液。

1.3 親水色譜條件

XBridgeTMAmide親水色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm，美國Waters公司)，流動相:A為水(含0.2%甲酸、20 mmol/L甲酸銨、20%甲醇)，B為乙腈，流速0.8 mL·min－1;柱溫為25℃;檢測波長為322 nm;進樣量20 μL，梯度洗脫程序為:0→15→25→30→40→50→55→65→70 min，B%:92%→90%→90%→87%→86%→82%→80%→80%→50%。

1.4 電噴霧飛行時間質(zhì)譜條件

進入ESI－TOF/MS的流動相流速為0.4 mL/min;ESI+模式;掃描范圍(m/z):50～1 500;干燥氣流速:10.0 L·min－1;噴霧氣壓:275.8 kPa;氣體溫度:300℃;毛細管電壓:4.5 kV;破碎電壓:120 V;錐孔電壓:60 V;參比液:m/z 121.050 9，922.009 8;分辨率:9 500±500(922.009 8)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品溶液制備方法的優(yōu)化

超聲提取技術(shù)利用超聲產(chǎn)生的強烈振動，加速藥物有效成分進入溶劑，從而提高提取率，縮短提取時間，并且避免了高溫對提取成分的影響［16］。本研究將超聲提取法用于桑葉親水色譜指紋圖譜研究。提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)等參數(shù)均是影響提取率的關(guān)鍵因素。對比了純水和不同比例甲醇水作為提取溶劑時的HILIC色譜圖。結(jié)果表明，甲醇水提取物的HILIC色譜圖中，色譜峰明顯增多，分布均勻，峰強度亦明顯增大，而純水提取物色譜峰主要分布在色譜圖的中間和后半時間段。說明HILIC法不但對強極性成分有較好的保留和分離效果，同時也適用于部分中等極性成分的保留和分離。其對應(yīng)的親水色譜圖反應(yīng)出的化學(xué)成分信息量明顯增加，指紋特征更加明顯，特征性更強，提高了指紋圖譜的整體性和特征性。因此，最終采用50%甲醇水溶液作為提取溶劑。在優(yōu)化的提取溶劑條件下，考察了不同提取時間(15、20、25 min)和提取次數(shù)(1、2、3次)的影響。結(jié)果表明，選擇桑葉樣品的提取時間為20 min，連續(xù)提取2次時，桑葉甲醇水提取物特征峰較高、指紋特征明顯。因此，最終選擇提取時間為20 min，連續(xù)提取2次。

2.2 親水色譜條件優(yōu)化

本研究在前期工作中曾對桑葉甲醇水提取液在反相色譜柱上的保留和分離情況進行初步研究。結(jié)果表明，桑葉甲醇水提取液在反相色譜圖的前半段色譜峰峰形較差、分離度不好，說明桑葉提取物中的強極性成分在反相柱上的保留和分離效果較差。因此，本研究采用親水柱用于桑葉甲醇水提取物的色譜分離研究，并對親水色譜條件進行優(yōu)化。由于桑葉的化學(xué)成分復(fù)雜，采用等度洗脫難以實現(xiàn)其分離，因此選擇梯度洗脫。乙腈－水體系常用于親水色譜流動相，桑葉甲醇水提取液中的強極性和中等極性成分共存，單獨采用乙腈－水體系難以實現(xiàn)各化合物的有效分離。而采用乙腈－水－甲醇三元混合體系時，桑葉甲醇水提取物中各化合物具有良好的保留和分離效果?？疾炝肆鲃酉鄍H值和緩沖鹽濃度等對親水色譜分離效果的影響，結(jié)果表明，選擇0.2%HCOOH+20 mmol/L HCOONH4作為流動相A時，桑葉甲醇水提取物中各化合物的分離度較好，峰形尖銳。采用光電二極管陣列檢測器考察桑葉樣品在不同波長(100～400 nm)下的親水色譜圖，結(jié)果表明，在203、256、265 nm和322 nm時色譜峰均較多，但在203、256 nm和265 nm時，色譜圖基線不平，干擾較大;而在322 nm處色譜峰較多，各峰分離度較好，基線平穩(wěn)，因此，本研究選擇檢測波長為322 nm。改變色譜柱溫度對色譜分離效果影響不大，但溫度對色譜柱的重現(xiàn)性有一定影響，在本研究過程中，色譜柱溫度控制在25℃(室溫)，以保證色譜分析過程的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。在優(yōu)化的親水色譜條件下，桑葉甲醇水提取物的親水色譜圖如圖1所示。

2.3 指紋圖譜的建立及特征峰的指認

取10批不同批次的桑葉樣品，按“1.2”方法制備成供試品溶液，按“1.3”親水色譜條件進樣分析，記錄其色譜圖，建立桑葉樣品的HILIC特征指紋圖譜，10批桑葉樣品的色譜圖見圖2。在本研究所建立的分析系統(tǒng)下，10批桑葉甲醇水提取物化學(xué)成分的出峰時間均在65 min之前，主要有17個共有峰。其中，特征性明顯的主要有4個色譜峰，這4個色譜峰即構(gòu)成桑葉HILIC指紋圖譜的特征峰(分別為峰3、9、11、15)(見圖1)。其中9號峰(綠原酸)的峰面積最大，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，保留時間以及峰面積的重復(fù)性良好，特征性強，與其它相鄰峰分離良好，采用化學(xué)工作站計算該峰的純度發(fā)現(xiàn)該峰為一純化合物，因此選擇9號峰為參照峰(相對保留時間和相對峰面積均設(shè)為1)，用于計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積(見表2～3)。從表2～3數(shù)據(jù)可以看出，各共有峰相對保留時間的RSD均小于5%，進一步說明本方法的可靠性;各峰相對峰面積的RSD值較大，但不同桑葉樣品指紋圖譜的輪廓特征一致(見圖2)。

圖1 桑葉提取物的親水色譜圖Fig.1 HILIC chromatogram for the extract of mulberry leaves

圖2 10批桑葉的HILIC特征指紋圖譜Fig.2 HILIC characteristic fingerprint of 10 batches of mulberry leaves

表2 相對保留時間Table 2 Relative retention time

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 精密稱取桑葉樣品，按“1.2”方法制成供試品溶液，按“1.3”親水色譜條件連續(xù)進樣6次，分別測得其中4個特征峰的峰面積和保留時間，計算其相對標準偏差(RSD)。4個特征峰保留時間的RSD依次為0.86%、0.62%、0.28%、0.22%，均小于1%，峰面積RSD依次為1.9%、2.1%、3.8%、0.59%，均小于5%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性 精密稱取同一桑葉樣品6份，按“1.2”方法制成供試品溶液，按“1.3”親水色譜條件進樣測定，測得4個特征峰的峰面積和保留時間，并計算其相對標準偏差。4個特征峰保留時間的RSD依次為0.65%、0.38%、0.28%、0.26%，均小于1%，峰面積RSD依次為1.2%、4.5%、1.3%、4.2%，均小于5%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。2.4.3 穩(wěn)定性 按照“1.3”親水色譜條件，將供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄色譜圖。4個特征峰保留時間的RSD依次為0.81%、0.75%、0.24%、0.18%，均小于1%，峰面積RSD依次為2.7%、2.9%、5.0%、5.0%，均不大于5%，表明樣品在24 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

表3 相對峰面積Table 3 Relative peak area

在優(yōu)化的親水色譜條件下，采用親水色譜－電噴霧飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對桑葉甲醇水提取物HILIC色譜圖中的4個特征峰進行表征。結(jié)果表明，在正離子模式下，4個特征峰有較好的質(zhì)譜信號。采用離子源預(yù)設(shè)的參數(shù)，各特征峰的信號較強。根據(jù)電噴霧飛行時間質(zhì)譜獲得的化合物的精確分子量信息和DAD檢測器獲得的紫外吸收信息，并參考相關(guān)文獻對4個特征峰進行了初步鑒別，結(jié)果見表4。從表4可以看出，4個特征峰中3、9、11號峰分別為槲皮苷、綠原酸、蘆丁，均為桑葉中的重要活性成分。

表4 4個特征峰的電噴霧飛行時間質(zhì)譜鑒別結(jié)果Table 4 ESI－TOF/MS accurate mass measurements of the 4 characteristic peaks

2.5 相似度評價

通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(《中國藥典》2004 A版)對10批山東產(chǎn)區(qū)桑葉藥材的指紋圖譜進行相似度分析。首先將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，選定上述17個共有峰進行譜峰匹配，采用共有模式作為對照指紋圖譜，用于10批桑葉藥材的相似度評價，相似度評價結(jié)果均在0.90以上(見表5)，說明這10批桑葉藥材的質(zhì)量差別不明顯。而兩個安徽、湖北來源的桑葉樣品相似度較低，其值均在0.90以下，說明不同產(chǎn)區(qū)的桑葉藥材質(zhì)量差異顯著。由此可以看出，本研究發(fā)展的HILIC特征指紋圖譜能夠反映桑葉藥材的固有屬性，結(jié)合相似度分析，可以用于不同產(chǎn)區(qū)桑葉藥材的辨別。

表5 相似度計算結(jié)果Table 5 Similarity calculations

3 結(jié)論

本研究以桑葉甲醇水提取物為研究對象，建立了桑葉藥材的HILIC特征指紋圖譜。在優(yōu)化的親水色譜條件下，桑葉甲醇水提取物中的各化合物分離良好。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法具有較好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。在多批次樣品分析的基礎(chǔ)上建立的桑葉親水色譜指紋圖譜，結(jié)合相似度分析可用于不同產(chǎn)區(qū)桑葉藥材的正確區(qū)分。本研究為更加全面、有效地控制桑葉藥材的質(zhì)量和真?zhèn)舞b別研究提供了方法和技術(shù)支持。

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