超高壓液相色譜法測(cè)定魚油中的EPA-EE和DHP-EE

陳偉珠，晉文慧，洪專，*，張怡評(píng)，方華，易瑞灶

（1.國家海洋局第三海洋研究所海洋生物資源化學(xué)與化工中心，福建 廈門 361005；2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005）

二 十 碳 五 烯 酸（cis-5，8，11，14，17-eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，DHA），屬于ω－3 系高度不飽和脂肪酸，其中EPA 被譽(yù)為“血管清潔劑”，DHA被稱為“腦黃金”。EPA 和DHA 是人體難以合成，需由食物供給的必需脂肪酸，是理想的功效食品或營養(yǎng)品。研究表明[1-2]，EPA、DHA 與人體許多生命現(xiàn)象有關(guān)，對(duì)維護(hù)人體健康有重要作用，目前廣泛應(yīng)用于各種保健食品中。EPA、DHA 都為人體所必需的脂肪酸，主要來自于海洋魚類，難以從一般食物中加以補(bǔ)充。當(dāng)前市場(chǎng)上魚油產(chǎn)品層出不窮，深受消費(fèi)者歡迎，但是由于產(chǎn)地、加工工藝等原因，其有效成分EPA、DHA含量存在較大差異，因此迫切需要建立起測(cè)定EPA、DHA 含量的快速有效的方法。由于EPA 和DHA 不穩(wěn)定，一般是做成酯類，通常采用乙酯化[3]。目前，關(guān)于二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）和二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）的檢測(cè)技術(shù)，文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)都采用常規(guī)的高效液相色譜方法[4-5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6]和氣相色譜方法[7]，運(yùn)行一個(gè)樣品需要10 min 以上。近年來，隨著商品化亞2 μm 填料的逐步推廣，構(gòu)建超高壓液相色譜系統(tǒng)（UPLC）及其分析方法已經(jīng)成為分析化學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。UPLC 是指一種采用小粒徑填料色譜柱（＜2 μm）和超高壓系統(tǒng)（＞105kPa）的新型液相色譜技術(shù)，可顯著改善色譜峰的分離度和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)大大縮短分析周期，特別適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道[8-13]。但目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)超高壓液相色譜在魚油中EPA-EE和DHA-EE 檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。本文擬采用超高壓液相系統(tǒng)建立起檢測(cè)魚油中EPA-EE 和DHA-EE 的快速、靈敏的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

超高壓液相色譜儀配TUV 檢測(cè)器：ACQUITY，美國Waters公司；ACQUITYUPLCTMBEHC18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）：美國Waters 公司；Milii-Q 超純水純化系統(tǒng)：美國Millipore 公司；百萬分之一分析天平：德國梅特勒公司。

1.2 試劑與材料

DHA-EE、EPA-EE：美國Sigma-Aldrich 公司；粗魚油：國內(nèi)某產(chǎn)家提供；乙腈：色譜純，美國天地有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱定EPA-EE 對(duì)照品13.041 mg 和DHA-EE 對(duì)照品12.914 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成EPA-EE 和DHAEE 儲(chǔ)備液（當(dāng)天使用），使用時(shí)用甲醇逐級(jí)稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMBEHC18（2.1mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（80∶20，體積比）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長：220nm，進(jìn)樣量3μL，柱溫：30℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化

對(duì)于液相色譜而言，流動(dòng)相的組成和配比對(duì)物質(zhì)分離的影響顯著。考察了以甲醇-水與乙腈-水分別為流動(dòng)相時(shí)的分離效果。在乙腈-水流動(dòng)相中，EPA-EE與DHA-EE 分離效果較好，繼續(xù)再調(diào)整乙腈與水的比例，比較了乙腈的比例分別為75%、80%和85%時(shí)對(duì)分離效果的影響（如圖1 所示）。

由圖1 可見，當(dāng)流速同為0.5 mL/min 時(shí)，乙腈-水（75∶25，體積比）、乙腈-水（80∶20，體積比）和乙腈-水（85∶15，體積比）這3 種流動(dòng)相，EPA-EE 與DHA-EE的都能達(dá)到基線分離，達(dá)到分析要求，尤其以乙腈-水（75∶25，體積比）為流動(dòng)相時(shí)效果最佳，分離度最大，但是綜合考慮運(yùn)行時(shí)間和分析，選擇乙腈-水（80∶20，體積比）作為流動(dòng)相。

2.2 流速的選擇與優(yōu)化

在確定乙腈-水（80∶20，體積比）為流動(dòng)相后，本文進(jìn)一步考察流速分別為0.3、0.4、0.5 和0.6 mL/min的分離情況。結(jié)果表明，在這幾種流速下，EPA-EE 和DHA-EE 都能完全達(dá)到基線分離，隨著流速增加，柱壓增高，保留時(shí)間縮短，如圖2 所示。綜合考慮分離度、保留時(shí)間和峰形及魚油中雜質(zhì)等因素，流動(dòng)相的流速定為0.5 mL/min，此時(shí)保留時(shí)間合理，峰形美觀對(duì)稱。

圖1 相同流速，相同柱溫，不同流動(dòng)相下EPA-EE 與DHA-EE 的色譜圖譜Fig.1 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE in different mobile phases with the same flow rate and the same column temperature

2.3 檢測(cè)波長及柱溫的確定

檢測(cè)波長根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，選擇220 nm 為檢測(cè)波長。柱溫考察了30、35、40 ℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同流動(dòng)相和流速的條件下，魚油中的EPA-EE 和DHA-EE 的保留時(shí)間隨著柱溫的升高而提前（如圖3 所示）。本文考慮到EPA-EE 和DHA-EE 分離效果和實(shí)際樣品中雜質(zhì)的問題，選擇柱溫為30 ℃。綜合上述的流動(dòng)相、流速試驗(yàn)的結(jié)果，確定色譜條件為流動(dòng)相為乙腈-水（80∶20，體積比），流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長220 nm。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限及定量限

分別精密量取EPA-EE儲(chǔ)備液100、200、400、800、1 000、1 500、2 000 μL 置于7 個(gè)5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制7 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。DHA-EE 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，與EPA-EE 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法相同，配制7 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣。每個(gè)樣品進(jìn)樣3 μL，按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

圖2 相同流動(dòng)相，相同柱溫，不同流速下EPA-EE 與DHA-EE 的色譜圖Fig.2 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE in the same mobile phases and the same column temperature with different flow rate

采用峰面積對(duì)其濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，EPA-EE 線性回歸方程為y=49 273.19x+0.60（y 為峰面積，x 為樣品濃度），相關(guān)系數(shù)r=0.999 4。DHA-EE 線性回歸方程為y=14 288x-466.1（y 為峰面積，x 為樣品濃度），相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。在各自的濃度范圍內(nèi)，EPA-EE和DHA-EE 的線性關(guān)系良好，而且線性范圍較寬。逐級(jí)稀釋溶液測(cè)定檢出限、定量限，當(dāng)信噪比（S/N）為3 時(shí)，EPA-EE 和DHA-EE 的檢出限分別為4 ng 和6 ng。當(dāng)信噪比（S/N）為10 時(shí)，EPA-EE 和DHA-EE 的定量限分別為10 ng 和15 ng。

2.5 精密度試驗(yàn)

圖3 相同流動(dòng)相，相同流速，不同柱溫下EPA-EE 與DHA-EE 的色譜圖Fig.3 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE in the same mobile phases and the same flow rate with different column temperature

表1 EPA-EE 和DHA-EE 線性測(cè)定結(jié)果Table 1 Calibration curve for EPA-EE and DHA-EE

分別取EPA-EE 和DHA-EE 配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為104 μg/mL 和103 μg/mL，精密吸取3 μL 進(jìn)樣，分別連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察儀器的精密度，EPA-EE和DHA-EE 的峰面積RSD 分別為1.09%和0.34%，表明本方法的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取EPA-EE 和DHA-EE 儲(chǔ)備液，配制濃度分別為104 μg/mL 和103 μg/mL 的供試品溶液，每種樣品同一濃度分別配制6 份，精密吸取3 μL 進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算EPA-EE 和DHA-EE 的重復(fù)性，結(jié)果EPA-EE 和DHA-EE 的重復(fù)性RSD 分別為1.54%和1.29%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

分別取EPA-EE 和DHA-EE 對(duì)照品適量，精密稱定，分別用甲醇溶解并稀釋制成每1 毫升約含EPAEE 和DHA-EE 80、100、120 μg 的溶液各3 份，作為供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。EPA-EE 平均回收率為102.26%，RSD 為1.33%，DHA-EE 平均回收率為96.64%，RSD 為1.05%，結(jié)果見表2。

表2 EPA-EE 和DHA-EE 回收率考察測(cè)定結(jié)果Table 2 The result of recovery for EPA-EE

表2 結(jié)果表明，本方法回收率良好。

2.8 魚油中EPA-EE 與DHA-EE 的檢測(cè)

利用本試驗(yàn)所建方法對(duì)兩種魚油樣品中EPAEE、DHA-EE 含量進(jìn)行檢測(cè)，并與參照國標(biāo)GB/T 17377-2008《動(dòng)植物油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜分析》[20]規(guī)定的色譜條件測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

表3 測(cè)定的魚油樣品的EPA-EE、DHA-EE 含量Table 3 The content of EPA-EE and DHA-EE in Sample by two methods

由表3 的結(jié)果可看到，用本文所建立的超高壓液相方法測(cè)定國內(nèi)某產(chǎn)家提供的兩種粗魚油的結(jié)果，與國家規(guī)定的的氣相色譜法測(cè)定的結(jié)果基本一致，但分析時(shí)間更短，操作更簡單。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超高壓液相色譜法快速測(cè)定魚油中的EPA-EE、DHA-EE 含量，流動(dòng)相簡單，分析時(shí)間短，一次進(jìn)樣只要6 分鐘，操作簡便，定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，此外，由于UPLC 使用填料顆粒小的短柱，柱容量較常規(guī)HPLC 小，因而檢測(cè)限也比常HPLC 低許多，可作為魚油中EPA-EE 和DHA-EE 的快速、靈敏的定量檢測(cè)方法。

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