金屬離子對桑黃菌絲體及胞外多糖含量的影響

高慧娟，劉雨晴，李娟輝，董瑞麗，王曉琴，賀旭陽，張萬恒，張芬琴，*

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.攀枝花市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川 攀枝花 617000）

桑黃是一類具有重要藥用價(jià)值的大型真菌，現(xiàn)代研究表明，桑黃多糖具有良好的抗癌和保肝護(hù)肝活性，并且無毒副作用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在我國，天然桑黃數(shù)量非常稀少，而桑黃菌的人工栽培尚處于起步階段，采用液體培養(yǎng)獲得具有藥理活性的菌絲體和胞外多糖，便于工業(yè)化生產(chǎn)[1]。研究結(jié)果表明，桑黃菌絲體的成分類似于子實(shí)體的活性成分[2]，蛋白質(zhì)含量和還原糖含量，分別是子實(shí)體中蛋白質(zhì)和還原糖含量的4 倍多，粗脂肪含量是子實(shí)體中含量的2 倍，脂肪酸含量和子實(shí)體中相當(dāng)，氨基酸總量較子實(shí)體中高，種類豐富，還含有黃酮類物質(zhì)和酚類物質(zhì)，與野生子實(shí)體相比，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和開發(fā)價(jià)值[3]。

金屬元素對微生物的生長繁殖和正常代謝不可或缺[4]。研究不同金屬離子對桑黃菌絲體生長速度的影響，不僅可以確定有利于桑黃菌絲體生長的金屬離子，同時(shí)也可以提高菌絲體中金屬離子含量，為人體補(bǔ)充相應(yīng)金屬離子，增加其藥用價(jià)值。目前，對于金屬離子對桑黃生長的影響的研究較少，本文通過平板培養(yǎng)和液體發(fā)酵，研究不同金屬離子對桑黃菌絲體生長速度、菌絲體干重、胞外多糖的含量的影響，為今后進(jìn)一步開發(fā)利用桑黃提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑黃菌種：由河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；PDA 培養(yǎng)基馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2 %，水1 000 mL，pH 自然。KCl、NaCl，CaSO4，MgSO4，F(xiàn)eSO4，ZnSO4，MnSO4，CuSO4為國產(chǎn)分析純。

BT8025B2H 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：深圳永業(yè)昌機(jī)電有限公司；MJX-160 型恒溫培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；CL-32L 型高壓滅菌鍋：ALP 公司；5A2003 型精密電子天平：良平儀器；TQHZ-2002A 型臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠；BDC-188 型冰箱：博西華家用電器有限公司；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大量金屬元素對菌絲體生長的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入1.1 中所列的大量金屬元素，分別設(shè)不同的濃度（1、3、5、7 mg/mL 和9 mg/mL），每種濃度設(shè)3 次重復(fù)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不加任何金屬離子作對照。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌30 min 后倒入65 mm 的平板中，每皿倒入15 mL；待培養(yǎng)基冷卻后，取直徑為6 mm 桑黃菌落一塊，置于平板中央，放在28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)9 d，用十字交叉法測定菌落直徑，求出生長速度（mm/d），記載菌絲生長勢（長勢濃密用“+++”表示，較濃密用“++”表示，稀疏用“+”表示，不生長用“-”表示），以及菌落顏色和形狀[5]。

1.2.2 微量金屬元素對菌絲體生長的影響

將1.1 中所列的微量金屬元素分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基含有不同微量元素，并將同一微量元素在培養(yǎng)基中的含量配制成不同的濃度（0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL 和0.9 mg/mL），每種濃度設(shè)三次重復(fù)，試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌30 min后倒入65 mm 的平板中，每皿倒入15 mL；待培養(yǎng)基冷卻后，取直徑為6 mm 桑黃菌落一塊，置于平板中央，放在28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)9 d，用十字交叉法測定菌落直徑，求出生長速度（mm/d），記載菌絲生長勢（長勢濃密用“+++”表示，較濃密用“++”表示，稀疏用“+”表示，不生長用“-”表示），以及菌落顏色和形狀[5]。

1.2.3 菌絲體干重的測定

取三塊6 mm 直徑大小的桑黃菌絲體，加入含有金屬離子的PDA 培養(yǎng)基中，同一金屬離子濃度重復(fù)三次，置于28 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為130 r/min。培養(yǎng)7 d 后取出，紗布過濾后，用自來水沖洗三次，放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，即為菌絲體干重[6]。

1.2.4 胞外粗多糖含量測定

取發(fā)酵液5 mL，加入10 mL 的乙醇，放入冰箱醇析過夜，得乳白色絮狀沉淀，然后用事先烘干稱重的濾紙過濾，再將含濾渣的濾紙放入60 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，則得到發(fā)酵液中粗多糖的含量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響

大量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響，見表1。

表1 大量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響Table 1 Effect of microelement on the mycelial growth of Phellinus igniarius

續(xù)表1 大量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響Continue table 1 Effect of microelement on the mycelial growth of Phellinus igniarius

由表1 中的結(jié)果表明：在分別含有3、5、7 mg/mL的Ca2+和1、3 mg/mL Mg2+的培養(yǎng)基上，桑黃菌絲體生長濃密、且菌絲生長速度顯著高于對照組；而分別在7 mg/mL 和9 mg/mL 的K+和Na+的培養(yǎng)基上菌絲體生長受到顯著的抑制作用，菌絲體顏色呈現(xiàn)淺黃色，菌絲體較稀疏，且菌絲生長速度顯著低于對照；分別含有1、3 mg/mL 的Na+，1 mg/mL K+，5 mg/mL Mg2+和9 mg/mL Ca2+的培養(yǎng)基上菌絲體生長速度較對照高，但是影響差異不顯著；而在3 mg/mL K+，7、3 mg/mL Mg2+和1 mg/mL Ca2+的培養(yǎng)基上，菌絲體生長速度較對照低，影響差異不顯著，結(jié)果見表1。說明較高濃度的Ca2+和Mg2+對桑黃菌絲體生長和胞外多糖分泌具有明顯的促進(jìn)作用，而高濃度的K+和Na+對桑黃菌絲體生長具有明顯的抑制作用。

2.2 微量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響

微量元素對桑黃菌絲生長的影響，見表2。

表2 微量元素對桑黃菌絲生長的影響Table 2 Effect of trace element on the mycelium growth of Phellinus igniarius

續(xù)表2 微量元素對桑黃菌絲生長的影響Continue table 2 Effect of trace element on the mycelium growth of Phellinus igniarius

從表2 中可以看到：在分別含有0.5 mg/mL 和0.7 mg/mL 的Fe2+和0.1 mg/mL Cu2+的培養(yǎng)基上，桑黃菌絲體生長濃密、且菌絲生長速度顯著高于對照組；而在濃度高于0.1 mg/mL Cu2+，0.9 mg/mL Fe+，0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL Mn2+的培養(yǎng)基上的菌絲體生長受到顯著的抑制作用，菌絲體顏色呈現(xiàn)淺黃色，菌絲體稀疏；在0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL Zn2+，0.1、0.3 mg/mL Fe2+，的培養(yǎng)基上，桑黃菌絲體生長速度較對照低，但影響差異不顯著；在0.1 mg/mL Mn2+和0.1 mg/mL Zn2+培養(yǎng)基上，桑黃菌絲體生長速度較對照高，但影響差異不顯著。

2.3 金屬離子對桑黃菌絲體干重及胞外多糖含量的影響

對促進(jìn)桑黃菌絲體生長的各種金屬離子加入到PDA 液體培養(yǎng)基中，桑黃菌絲體和胞外多糖含量見表3。

表3 金屬離子對桑黃菌絲體干重及胞外多糖含量的影響Table 3 Effect of metal ions on the Mycelium dry weight and Extracellular polysaccharide of the Phellinus igniarius

續(xù)表3 金屬離子對桑黃菌絲體干重及胞外多糖含量的影響Continue table 3 Effect of metal ions on the Mycelium dry weight and Extracellular polysaccharide of the Phellinus igniarius

從表3 中可以看到，3、5 mg/mL 和7 mg/mL Ca2+的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體干重極顯著高于對照組，較空白對照菌絲體干重高出，1 mg/mL 和3 mg/mL Mg2+，3 mg/mL Na+以及0.7 mg/mL Fe2+的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體干重顯著高于對照組；0.1 mg/mL Zn2+，3 mg/mL K+，3 mg/mL Na+，0.5 mg/mL Fe2+，7 mg/mL Ca2+和0.7 mg/mL Fe2+的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中胞外粗多糖的分泌顯著高于對照組。

2.4 結(jié)果討論

微生物在生長及其次級代謝過程各種金屬元素如鉀、鈉、鎂、錳、銅、鐵、鋅、鈣等起著極其重要的作用。鈣是微生物重要的陽離子，是蛋白酶的激活劑[8]；鎂在糖酵解、呼吸、氧化磷酸化等過程中起重要作用，是各種激酶，檸檬酸裂合酶和堿性磷酸酶等的輔助因子，是多種酶的激活劑，同時(shí)鎂對重金屬如鈷和鎳的毒性有拮抗作用；鐵是細(xì)胞色素和鐵氧化還原蛋白的氧化還原反應(yīng)中必不可少的電子載體，在電子傳遞體系中起至關(guān)重要的作用；鋅是各種金屬蛋白酶、碳酸酶、醇脫氫酶等的輔助因子[9]。金屬離子是微生物生長繁殖不可或缺的營養(yǎng)要素，也是微生物正常代謝必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì)[4]。在C/N 一定的條件下，培養(yǎng)基中的金屬離子對細(xì)胞生長有著重要的影響[10]。適量的金屬離子可以對真菌的生長，次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有明顯的作用[11]。

金屬離子對桑黃菌絲體生長和胞外多糖分泌也有重要影響，Ca2+，Na+，Mg2+和Fe2+對菌絲體生長具有明顯的促進(jìn)作用，菌絲體干重明顯高于對照組，Na+，Zn2+，K+，和Fe2+對桑黃胞外多糖的分泌具有促進(jìn)作用，而Fe2+，Mg2+，Ca2+在較大濃度時(shí)促進(jìn)桑黃菌的生長。桑黃菌對金屬離子尤其是Cu2+、Mn2+、Zn2+等微量金屬離子的需要量極少，這些離子在較低濃度時(shí)能刺激生長與代謝，對桑黃菌的生長有促進(jìn)作用，高濃度有抑制作用因?yàn)樗鼈儠捅匾钠渌夹g(shù)競爭含硫化合物和氧的結(jié)合位點(diǎn)，破壞核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，干擾氧化磷酸化和滲透壓平衡。另外，培養(yǎng)基中加入金屬鹽離子，會引起細(xì)胞滲透壓的變化，從而影響真菌的生長，高濃度的重金屬可以抑制微生物的生長和繁殖、阻遏呼吸作用、使細(xì)胞形態(tài)異常甚至使細(xì)胞裂解、改變核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、干擾氧化磷酸化、影響細(xì)胞滲透壓平衡、重金屬脅迫培養(yǎng)對微生物生長的影響[12]。

3 結(jié)論

1）不同濃度的大量金屬元素對桑黃菌絲體生長速度的影響不同，3、5mg/mL 和7mg/mL 的Ca2+和1mg/mL 和3mg/mLMg2+促進(jìn)菌絲體生長；在7mg/mL 和9 mg/mL 的K+，7 mg/mL 和9 mg/mL Na+抑制菌絲體生長。

2）在液體搖瓶發(fā)酵中，3、5、7 mg/mL Ca2+，1、3 mg/mL Mg2+，3 mg/mL Na+和0.7 mg/mL Fe2+的培養(yǎng)基促進(jìn)菌絲體干重量的積累，是空白菌絲體干重量的5 倍～8 倍；而0.1 mg/mL Zn2+，3 mg/mL K+，3 mg/mL Na+，0.5、0.7 mg/mL Fe2+，7 mg/mL Ca2+和的培養(yǎng)基促進(jìn)胞外粗多糖的分泌，3 mg/mLNa+中胞外多糖含量高達(dá)0.7105g/100mL。

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