荔枝果皮中4種酚類代謝酶活性的測定方法

李曉靜，黃旭明，胡桂兵，王惠聰

(華南農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，廣東 廣州510642)

植物體中存在各種不同的多酚類化合物，包括具有1 個芳香環(huán)的簡單多酚類化合物(Simple phenols)，2 個芳香環(huán)的類黃酮(Flavonoids)和花色素(Anthocyanidins)，多個芳香環(huán)原花青素(Proanthocyanidin)等［1］.由于多酚類化合物具有抗氧化、清除自由基、控制人類慢性病的發(fā)病率、保護DNA 和抗突變、抑制癌癥發(fā)生等方面的功效，近年來備受關(guān)注，被譽為繼水、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維之后的第八大必需營養(yǎng)［2］.花色素作為賦予植物顏色的四大天然色素(葉綠素、類胡蘿卜素、花色素和甜菜堿)之一，是決定果實和觀賞植物顏色的一類重要色素［3］.此外，多酚類物質(zhì)還與果實的采后褐變關(guān)系密切［4］，還參與植物的應逆反應，脅迫條件往往會增加植物組織的多酚類物質(zhì)的含量［5-6］.

植物的酚類代謝途徑是研究最為清楚的植物次生物質(zhì)代謝之一.多酚類物質(zhì)的生物合成在許多植物中均有深入的研究，有學者先后克隆了相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，并研究了它們在果實發(fā)育過程中的表達［7-9］.酶是基因表達的產(chǎn)物，在多酚物質(zhì)代謝中苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化苯丙氨酸產(chǎn)生肉桂酸，是酚類物質(zhì)合成的第1 個酶，也是關(guān)鍵酶;類黃酮合成相關(guān)的酶主要是查兒酮合成酶(CHS)和查兒酮異構(gòu)酶(CHI);原花青素和花色素苷合成密切相關(guān)的酶主要是二氫黃酮醇還原酶(DFR)和類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT).酶活性是基因表達結(jié)果最直接的體現(xiàn)，往往與qPCR 一起用于揭示酚類物質(zhì)代謝的內(nèi)在機制，但在實際工作中，由于酚類代謝底物較難獲得，試驗方法對研究者的試驗技能要求較高等原因，許多研究者在研究中往往選擇qPCR 而放棄酶活性的測定，然而目前一些知名的國際雜志往往要求基因表達結(jié)果和酶活性相互印證.

荔枝是南方重要的常綠果樹，荔枝果實的多酚類物質(zhì)與采后的褐變［4］、果實著色［9］以及天然功能性成分的開發(fā)利用［10］等關(guān)系密切，是荔枝果實品質(zhì)研究的一個重要方面.本研究組多年從事荔枝果實酚類和花青苷代謝研究，建立了多酚類和花色苷生物合成關(guān)鍵酶活性的測定方法.之前發(fā)表的相關(guān)文章由于篇幅限制，未能詳細介紹酶活性的測定方法，近年我們又對測定方法進行了改進，許多國內(nèi)同行專家發(fā)郵件咨詢酚類代謝酶的測定方法，有鑒于此，本文以荔枝果皮為材料，詳細介紹4 個酚類代謝關(guān)鍵酶的酶活性測定方法及注意事項，以期為相關(guān)的研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1．1 植物材料

研究選取‘黑葉’荔枝品種作為試驗材料，每個處理選取3 棵樹，在盛花后42 d 開始采樣直至果實成熟，采樣時將果皮和果肉分開，打孔器取果皮圓片裝入錫紙袋，用液氮速凍后帶回實驗室，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1．2 PAL 提取和活性測定

PAL 的提取和測定參考Lister 等［11］報道的方法，并加以改進.取2 個果皮圓片(約0.2 g)在液氮中迅速研磨成粉末，加入1.8 mL 提取液［含100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.8)，質(zhì)量濃度為20 g·L-1的牛血清蛋白(BSA)，5 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)］，勻漿后迅速轉(zhuǎn)移到2 mL 的離心管中.在4 ℃條件下，12 000 r·min-1離心10 min，取1 mL 上清液過PD10(GE.Healthcare? ，Buckinghamshire，UK)脫鹽柱后，備用.過脫鹽柱的具體操作為:先用平衡液［含100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.8)，5 mmol·L-1DTT］沖洗柱子，平衡液降到隔板下后加入1 mL 酶提取液，酶提取液降到隔板后加入1.8 mL 平衡液，不收集濾液，等平衡液降到隔板后(此時取2 mL 凍存管于柱子下端準備接收濾液)，再加入2 mL 平衡液并收集濾液，作為純化酶液.

酶反應體系包括純化酶液0.5 mL、平衡液0.7 mL 和100 mmol·L-1的苯丙氨酸100 μL，在37 ℃條件下反應45 min 后，用200 μL 質(zhì)量濃度為350 g·L-1的三氯乙酸終止反應，10 000 r·min-1離心5 min 除去變性的蛋白質(zhì).取上清液在290 nm 下測定光密度，對照試驗用不加苯丙氨酸的反應液代替正常的反應液進行，酶活性用反應生成的肉桂酸含量表示，單位為μmol·g-1·min-1:

其中，19.207 為肉桂酸在290 nm 下的μmol 吸光系數(shù);1.8 為加入提取液的體積(mL);2 為酶液在過脫鹽柱后的稀釋倍數(shù);1.5 為反應體系的體積(mL);0.5 為反應體系中酶液的體積(mL);m鮮為樣品的鮮質(zhì)量(g).

1．3 CHI 和DFR 提取和活性測定

CHI 和DFR 的提取在Lister 等［11］報道方法的基礎上有所改進.取2 個果皮圓片(約0.2 g)在液氮中迅速研磨成粉末，加入1.8 mL 提取液［含100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5)，質(zhì) 量 濃 度 為20 g·L-1的BSA，5 mmol·L-1DTT］，勻漿后迅速轉(zhuǎn)移到2 mL 的離心管中.在4 ℃條件下，12 000 r·min-1離心10 min，取1 mL 上清液過PD10 脫鹽柱后備用.平衡液含100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5)和5 mmol·L-1DTT，脫鹽的程序同1.2.

CHI 活性測定的反應體系為1 mL，包括酶液25 μL、Tris-HCl(pH 7.5，含50 mmol·L-1KCN)965 μL和20 mmol·L-1查爾酮(Aldrich 136123)10 μL，室溫下370 nm 處測定酶動力，以每分鐘光密度變化0.01 所需的酶量為1 個活性單位，即1U.

其中，0.01 為規(guī)定的1 個酶單位的光密度變化量;1.8 為加入提取液的體積(mL);2 為酶液在過脫鹽柱后的稀釋倍數(shù);0.025 為反應體系中酶液的體積(mL)，m鮮為樣品的鮮質(zhì)量(g).

DFR 活性的測定參考Stafford 等［12］的方法，并加以改進.反應體系1 mL，包括酶提取液600 μL，1 mmol·L-1脫氫槲皮素(Dihydroquercetin，F(xiàn)luka 78666)20 μL，0.3 mmol·L-1的NADPH 40 μL，100 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5)340 μL.以600 μL 酶液沸水浴5 min 冷卻后加入其他反應液為對照.在30 ℃條件下反應1 h，之后加入1 mL 的乙酸乙酯終止反應，在振蕩器上充分振蕩，靜置分層后取上層液到玻璃試管中，重復加入乙酸乙酯提取3 次，合并上層液，RapidVap?(Labconoco，MO，USA)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)系統(tǒng)中蒸干后，加入1 mL 正丁醇-HCl 溶液［V(正丁醇)∶V(HCl)=95∶5］，95 ℃水浴15 min，測定550 nm的光密度，以每分鐘光密度變化0.01 所需的酶量為1個酶活性單位，即1 U.

其中，0.01 為規(guī)定的1 個酶單位的光密度變化量;1.8 為加入提取液的體積(mL);2 為酶液在過脫鹽柱后的稀釋倍數(shù);0.6 為反應體系中酶液的體積(mL);m鮮為樣品的鮮質(zhì)量(g).

1．4 UFGT 提取和活性測定

UFGT 的提取和活性測定在Ford 等［13］報道方法的基礎上加以改進.取2 個果皮圓片(約0.2 g)在液氮中迅速研磨成粉末，加入1.8 mL 提取液［含100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，10 mmol·L-1DTT，1.5 mmol·L-1苯甲基磺酰氟，質(zhì)量濃度為20 g·L-1的BSA，體積分數(shù)分別為10% 的甘油和0.1% 的TritonX-100］，勻漿后迅速轉(zhuǎn)移到2 mL 的離心管中，4℃條件下，12 000 r·min-1離心10 min，取1 mL 上清液過PD10 脫鹽柱后備用.平衡液含100 mmol·L-1Tris-Hcl(pH 8.0)、5 mmol·L-1DTT，脫鹽的程序同1.2.

酶反應體系包括100 μL 酶液和100 μL 反應液［含100 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)，50 mmol·L-1PEG(4000)，14 mmol·L-1β-巰基乙醇，2 mmol·L-1的DTT，10 mmol·L-1的Cyanidin(Sigma79457)和9 mmol·L-1的脲苷二磷酸葡萄糖(UDPGlu，Sigma U4625)］.30 ℃反應20 min，150 μL 體積分數(shù)為5%的HCl 終止反應，以100 μL 酶液加入反應液后立即加入150 μL 的HCl 為對照，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.45 μm 水系濾頭，用HPLC 測定反應生成的花青苷.

花青苷含量的檢測參考Wei 等［9］報道的方法，使用Angilent 1200 HPLC 系統(tǒng)(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)，配有四元泵、DAD 檢測器(G1315D)、餾分收集器(G1364C)、柱溫箱、自動進樣器，使用250 mm×4.6 mm NUCLEODUR? C18 色譜柱(Macherey-Nagel GMBH＆Co.KG，Germany)，檢測波長520 nm，進樣量10 μL，采用梯度洗脫方式:流動相A 用體積分數(shù)為1.6%的甲酸甲醇溶液，流動相B用體積分數(shù)為1.6%的甲酸水溶液，梯度洗脫時間見表1.采用HPLC 系統(tǒng)分離早熟荔枝果皮提取液，餾分收集器收集矢車菊色素-3-葡萄糖苷，旋轉(zhuǎn)減壓蒸干后作為標樣，對反應生成的花青苷進行定量.

表1 荔枝果皮花色苷HPLC 分離檢測梯度洗脫時間表Tab．1 The gradient elution program for HPLC separation of anthocyanins in the pericarp of litchi

2 結(jié)果與分析

2．1 荔枝果皮中PAL、CHI 和DFR 活性

在花后42～56 d‘黑葉’荔枝果皮中PAL 活性變化不大，活性介于5.5～7.0 μmol·g-1· min-1，在花后63 d 活性明顯下降，隨后在果實成熟著色時活性明顯增加(圖1a).在花后42 d‘黑葉’荔枝果皮中CHI 活性較低，隨著果實發(fā)育活性增加，著色前(花后63 d)活性降低，此后隨著果實的成熟著色活性增加(圖1b).‘黑葉’荔枝果皮中DFR 活性在果實發(fā)育中期較高，在果實著色過程中活性下降(圖1c).

2．2 荔枝果皮中UFGT 活性

如圖2a，酶反應對照液僅在23.4 min 左右出峰，峰面積為61.2，該峰是反應液中加入的矢車菊色素，本研究使用的是花后70 d 的‘黑葉’荔枝果皮樣品，果皮已經(jīng)開始著色，經(jīng)過了脫鹽去雜處理后，未檢測到在14 和16 min 左右出峰的矢車菊色素-3-葡萄糖苷和矢車菊色素-3-蕓香糖苷，說明酶提取液純化后很好地去除了本底的干擾.反應液終止反應10 min 后檢測到較少的矢車菊色素(23.4 min)，峰面積為8.296，而且在13.9 min 出現(xiàn)了對照未出現(xiàn)的峰，經(jīng)標樣確定該峰是反應產(chǎn)生的矢車菊色素-3-葡萄糖苷(圖2b);將反應液放置近2 h 后再次進樣(圖2c)，發(fā)現(xiàn)23.4 min 的矢車菊色素峰值明顯變小，而13.9 min 的矢車菊色素-3-葡萄糖苷峰面積變化不大，說明在反應液中矢車菊色素很不穩(wěn)定，容易降解，而反應產(chǎn)生的矢車菊色素-3-葡萄糖苷則相對穩(wěn)定.

如圖1d，在‘黑葉’荔枝果實發(fā)育的早期，果皮中基本上檢測不到UFGT 活性，在謝花后56 d 果皮中的UFGT 活性僅為(0.04 ±0.02)μmol·g-1·min-1，此后，隨著果實成熟著色UFGT 活性迅速增加，在果實成熟采收時果皮中的UFGT 活性達到最高，即(2.19 ±0.23)μmol·g-1·min-1.

圖1 ‘黑葉’荔枝果皮發(fā)育過程中PAL、CHI、DFR 和UFGT 活性的變化Fig.1 Changes in the activities of PAL，CHI，DFR and UFGT in the pericarp of Litchi chinensis cv.Heiye during fruit development

圖2 花后70 d‘黑葉’荔枝果皮UFGT 反應液HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC spectra of UFGT reaction mixture in the pericarp of Litchi chinensis cv.Heiye 70 d after flowering

3 討論

3．1 PAL 測定方法

‘黑葉’荔枝果實發(fā)育的早中期PAL 活性較低，隨后在果實成熟著色時活性明顯增加.測定結(jié)果與前人的研究基本一致.‘妃子笑’荔枝果皮著色過程中PAL 活性也有較明顯的增加［14］.在草莓、蘋果和梨等果實成熟著色的過程中果皮的PAL 活性明顯增加［15-17］.

與之前的測定方法相比，本研究中PAL 的測定方法主要在3 個方面做了改進:1)利用過PD10 脫鹽柱的方法對酶提取液進行純化，去掉酶提取液中的雜質(zhì)，雜質(zhì)包括酚類物質(zhì)和小分子的鹽和糖，使結(jié)果更加穩(wěn)定和可靠;2)加入BSA 對酶蛋白進行保護，以DTT 代替巰基乙醇，減少試驗過程中刺激性的氣味;3)利用與反應液一致的平衡液，增加純化酶液的使用量，適用于少樣品或酶活性低的試驗.本研究中使用0.5 mL 純化酶液，在樣品量少或酶活性偏低的樣品中可以通過增加純化酶液降低平衡液的使用量來增加測定的穩(wěn)定性.

在試驗的過程中應注意:1)設置對照試驗;2)反應底物苯丙氨酸較難溶于水，可先加入少量的1 mol·L-1的NaOH 溶液，溶解后再加水定容;3)加入三氯乙酸后蛋白質(zhì)變性有沉淀析出，在比色前要離心.

3．2 CHI 的測定方法

在花后42 d‘黑葉’果皮中CHI 活性較低，隨著果實發(fā)育活性增加，著色前(花后63 d)活性降低，此后隨著果實的成熟著色活性增加.這與前人在果實成熟過程中CHI 活性增加的報道基本一致［16］.

之前由于購買不到查爾酮作為CHI 反應的底物，而采用Moustafa 等［18］報道的方法，由柚皮素加入質(zhì)量濃度為500 g·L-1的KOH 后酸化，然后用乙醇進行重結(jié)晶備用反應底物2'，4，4，6'-四氫苯基苯乙烯酮，制備的方法較難掌握，增加了CHI 活性測定的難度.目前可以從Sigma-Aldrich 直接購買CHI 反應的底物，反應底物的純度也更有保證.在CHI 的酶反應體系中除了加入BSA 保護酶活性外，還應加入KCN 防止多酚氧化酶對查爾酮的降解.KCN 屬于劇毒試劑，在試驗結(jié)束后，應對廢液和剩余的試劑進行無害化處理.首先將廢液用水稀釋，再按每升加約35 mL 的比例加入次氯酸鈉，混勻，敞開過夜，使CN-氧化成CO2和N2揮發(fā)，或水解成CO2-3和NH+4，再排入下水道.

在試驗過程中，反應底物的溶解往往是測定成敗的關(guān)鍵.查爾酮不溶于水，可溶于堿和醇:查爾酮溶于堿后，隨著時間推移溶液由黃色轉(zhuǎn)為棕褐色，作為底物加入反應體系后，對照的D370nm不降低反而增加，因此不能作為底物;查爾酮溶于無水乙醇后保持黃色，加入反應體系后，D370nm降低，活性與加入的酶量成正比.

3．3 DFR 的測定方法

與在‘妃子笑’荔枝果皮中測定的結(jié)果［14］一致，‘黑葉’荔枝果皮中DFR 活性在果實發(fā)育中期活性較高，在果實著色過程中活性下降.Ju 等［19］在蘋果上的研究發(fā)現(xiàn)，果皮的DFR 活性隨著果實成熟著色而增加，但其研究中DFR 活性是以每毫克蛋白計算的，本研究的DFR 活性是以每克鮮質(zhì)量計算的，而荔枝果皮的蛋白含量是隨著果皮的發(fā)育成熟而明顯下降.

與PAL 活性的測定類似，本研究DFR 活性的測定也增加了酶純化和酶液的使用量，適用于酶活性較低和樣品量較小的材料，底物脫氫槲皮素應采用甲醇溶解，配成高濃度儲存.

3．4 UFGT 的測定方法

‘黑葉’荔枝果皮隨著果實成熟著色UFGT 活性迅速增加，這與前人在草莓和葡萄上的研究結(jié)果［15，20］相一致，也與在‘妃子笑’荔枝上的研究結(jié)果［14］一致.

本試驗在酶液提取和酶反應體系上均有改進，采用緩沖液提取加酶純化去雜代替-20 ℃丙酮加緩沖液溶解的方式，在提取緩沖液中加入PMSF、BSA、甘油和TritonX-100，保護酶活性并保證提取效率;反應體系中加入滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)PEG(4000)以及β-巰基乙醇和DTT 保護酶活性.

由于不同物種UFGT 對于糖供體如UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的親和性有很大的差異［21］，在具體的試驗中應根據(jù)樣品特點選擇正確的糖基供體.與其他3 個酶試驗一樣，在反應體系中反應底物的配制十分重要，在UFGT 試驗中底物矢車菊色素可溶于水，但溶解性較差，且在水溶液中很快降解，正確的方法是用乙二醇甲醚配成100 倍以上的母液凍存，在反應前配制反應液，現(xiàn)配現(xiàn)用.由于反應液中的底物矢車菊色素和UDPG 價格昂貴，因此應控制反應體系的量，在進行HPLC 檢測反應產(chǎn)物的過程中可在常規(guī)樣品瓶中加內(nèi)插管以適應微量樣品的進樣.

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