草魚Smad4基因的克隆、生物信息學(xué)分析及反義真核載體的構(gòu)建

呂池波，郁二蒙，謝 駿，王廣軍，余德光，李志斐，王海英，龔?fù)麑?/p>

(1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510380;2 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306)

在Smads 蛋白家族中已發(fā)現(xiàn)9 個成員［1］，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的差異可分為通用型、受體激活型和抑制型Smads.通用型Smads 的主要功能是與受體激活型Smads 結(jié)合形成異源寡聚體，將信號轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)［2］，目前僅發(fā)現(xiàn)Smad4 這1 種.Smad4 是TGF-β/smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的中心轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它通過形成異源寡聚體，將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)［3］，因此它的表達(dá)情況與生長、發(fā)育等生命過程密切相關(guān).在魚類研究中，只有斑馬魚Danio rerio、鯉Cyprinus carpio、虹鱒Oncorhynchus mykiss、金魚Carassius auratus 等少數(shù)物種的Smad4 基因被克隆.在鯉體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Smad4 基因有不同的組織表達(dá)模型，暗示著Smad4 通過改變組織表達(dá)水平來調(diào)控TGF-β 信號通路［4］.在斑馬魚胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)Smad4 的時(shí)空分布廣泛且表達(dá)量大，而與之相關(guān)的Smad3 基因呈現(xiàn)一種空間限制性表達(dá)模式［5］.將金魚的Smad4結(jié)構(gòu)與Smad2、Smad3 及Smad7 比較分析發(fā)現(xiàn)，Smad4 編碼的氨基酸序列中間連接區(qū)域少了42 個氨基酸，這可能就是它在LT-2 細(xì)胞中失活的原因［6］.目前，有關(guān)草魚Smad4 基因的研究鮮見報(bào)道.

研究基因功能常用的方法有基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)、反義技術(shù)、基因敲除和敲入、基因誘捕技術(shù)等，其中反義技術(shù)利用DNA 或RNA 分子通過Watson-Crick 堿基配對原則與目的基因的mRNA 互補(bǔ)結(jié)合，通過各種機(jī)制使其降解或抑制其編碼蛋白的翻譯，從而抑制特定目的基因的表達(dá)［7］.作為反義技術(shù)中的一種，反義轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為下調(diào)生物體內(nèi)源目的基因表達(dá)效果的一種有效手段.其中，具有延熟保鮮特性的轉(zhuǎn)基因番茄Solanum lycopersicum 的培育是最經(jīng)典的成功范例［8］.采用反義轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入反義重組基因，以抑制機(jī)體內(nèi)的基因表達(dá)，可阻斷其生理功能.中國科學(xué)院水生生物研究所研究團(tuán)隊(duì)利用促性腺激素釋放激素的反義基因抑制了轉(zhuǎn)基因鯉魚中促性腺激素的合成和性腺發(fā)育［9］;反義桃拉綜合病毒外衣蛋白基因轉(zhuǎn)基因蝦顯著增強(qiáng)了病毒抵抗力［10］.在有關(guān)Smad4 基因的研究中，通過構(gòu)建反義Smad4 真核表達(dá)載體可以抑制Smad4 蛋白的表達(dá)，從而減少Ⅰ型膠原的表達(dá)量［11］.為此，本研究擬通過PCR 方法和RACE 技術(shù)獲得草魚Smad4 cDNA 全序列，并將開放閱讀框(Open reading frame，ORF)序列反向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建Smad4 基因反義真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Anti-Smad4，期望為進(jìn)一步研究Smad4 基因在草魚胚胎發(fā)育過程中的生理機(jī)制打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

2010年5月在廣東省中山食品水產(chǎn)集團(tuán)有限公司南頭養(yǎng)殖場采集3 尾體質(zhì)健康的草魚，體質(zhì)量為(2.0 ±0.10)kg，去鱗解剖后，采集肌肉組織，并立即置于液氮中保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-40 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?

1．2 主要試劑

總RNA 提取試劑盒(百泰克公司);DNA Marker DL2000、PrimeScriptTMRT-PCR Kit、pMD19-T 載體、DH5α、LA Taq DNA 聚合酶、EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ和T4 DNAligase(大連TaKaRa 公司);SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech 生物工程公司);Plasmid Mini KitⅠ、Gel Extraction Kit(OMEGA 公司).

1．3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA 提取與cDNA 的合成 RNA 提取參照百泰克公司總RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度，然后使用微量分光光度計(jì)測總RNA 濃度.按照TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR Kit 說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:Oligo dT Primer 1 μL、總RNA 4 μL、dNTP Mixture 1 μL、RNase Free ddH2O 4 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃5 min，4 ℃條件下保存;然后加入5×PrimeScript ⅡBuffer 4 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、PrimeScript ⅠRTase 1 μL 和RNase Free ddH2O 4.5 μL，反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃ 30 min，95 ℃5 min，4 ℃條件下保存.

1.3.2 草魚Smad4 基因cDNA 全序列克隆 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增草魚Smad4 基因核心序列片段.PCR 反應(yīng)體系25 μL:ddH2O 19.7 μL、PCR Buffer 2.5 μL、4×dNTP Mixture 0.5 μL、cDNA 1 μL、Smad4 F(5'-TGTGTGACCATACAGAGAAC-3')0.5 μL、Smad4 R(5'-TCCAGCAGGGCGTCTCTTTA-3')0.5 μL 、LA Taq 0.3 μL.PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃5 min;94℃1 min，65 ℃30 s，72 ℃90 s，30個循環(huán);然后72 ℃延伸8 min.PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收并克隆、測序，所得的cDNA 片段與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的已有物種的Smad4 cDNA 序列進(jìn)行BLAST 相似性分析.

3'RACE 試驗(yàn)按照SMARTTMRACE cDNA Amplification 說明書進(jìn)行.用上述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、5×PCR Buffer 10 μL、ddH2O 28.75 μL、TaKaRa Ex Taq? HS 0.25 μL、Smad4-3' RACE(5'-CCTGCTATCAGTTTGTCT-3')0.5 μL、M13 Primer M4 0.5 μL 進(jìn)行首次PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min.巢式PCR 使用的引物為M13 Primer M4 和Smad4-3' 2RACE(5'-ACCCACGGCAGAGCATTA-3').PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳檢測后進(jìn)行膠回收，并克隆測序.

根據(jù)前一步克隆的Smad4 基因的cDNA 序列，設(shè)計(jì)2 個下游引物Smad4-5'RACE(5'-GTAGGGGTTCACACAGAC-3')與Smad4-5'2RACE(5'-AGCGTTCTCTGTATGGTC-3')，合成5'RACE cDNA 方法參照試劑盒說明書進(jìn)行.首次PCR 反應(yīng)體系:10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL、dNTP Mix(10 mmol/L)1 μL、10×UPM 5 μL、Smad4-5' RACE 1 μL、5'-RACEReady cDNA 2.5 μL、50×Advantage 2 Polymerase Mix 1 μL、PCR-Grade water 34.5 μL.反應(yīng)程序與3'RACE一致，將退火溫度改為65 ℃，循環(huán)數(shù)為25.取首次PCR 產(chǎn)物5 μL，用Tricine-EDTA Buffer 稀釋50 倍.然后取5 μL 作為模板，引物為Smad4-5' 2RACE 和NUP 各1 μL，進(jìn)行巢式PCR 反應(yīng).RACE 試驗(yàn)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并克隆測序.

1.3.3 草魚Smad4 基因的生物信息學(xué)分析 Smad4基因的分析、Smad4 蛋白的疏水性分析及功能結(jié)構(gòu)域分析在expasy 網(wǎng)站(http:∥www.expasy.org/)完成;蛋白功能位點(diǎn)及二級結(jié)構(gòu)分析在https:∥www.predictprotein.org/完成;系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA4.0軟件完成.

1.3.4 Smad4 基因ORF 片段的獲得與鑒定 以反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 為模板，設(shè)計(jì)引物P1(5'-ATGTCTATCACAAACACGCCCACC-3')、P2(5'-TCAGTCTAACGGCGTGGGGTC-3')，PCR 擴(kuò)增Smad4 基因ORF片段，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后回收并克隆測序.

1.3.5 帶酶切位點(diǎn)的Smad4 基因ORF 片段的獲得與鑒定 將上述進(jìn)行過驗(yàn)證的菌液提取質(zhì)粒pMD19-T-Anti-Smad4，并以此為模板，P3(5'-CCGCTCGAGATGTCTATCACAAACACG-3')、P4(5'-CGGAATTCTCAGTCTAACGGCGTGGG-3')(加粗的為保護(hù)堿基，帶下劃線為酶切位點(diǎn))為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.3.2.獲得兩端含有XhoⅠ和EcoRⅠ2 個酶切位點(diǎn)的Smad4 ORF 片段.PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后回收并克隆測序.

1.3.6 反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建 如圖1 所示，將Smad4 片段反向插入pcDNA3.1(+)載體中.同時(shí)用XhoⅠ和EcoRⅠ對質(zhì)粒pcDNA3.1(+)進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系:Xho Ⅰ1 μL，EcoR Ⅰ1 μL，10×H Buffer 2 μL，質(zhì)粒1 μg，加無菌水至20 μL.反應(yīng)條件:37 ℃，2 h.利用相同的反應(yīng)體系對pMD19-T-Anti-Smad4 進(jìn)行雙酶切.產(chǎn)物進(jìn)行10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，按照OMEGA膠回收試劑盒說明書純化回收目的片段.連接載體和Smad4 片段，反應(yīng)體系:10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL，Smad4 酶切片段15 μL，pcDNA3.1(+)酶切片段2 μL，T4 DNA Ligase 1 μL.16 ℃連接15 h，轉(zhuǎn)化并將菌液送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序.

圖1 反義Smad4 重組載體圖譜Fig.1 Recombinant vector of antisense Smad4

1.3.7 重組載體的PCR 檢測和酶切鑒定 提取重組載體pcDNA3.1(+)-Anti-Smad4，方法按照OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行.以P1、P2 為引物，抽提的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 檢測，反應(yīng)體系和條件同1.3.2.用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切重組載體pcDNA3.1(+)-Anti-Smad4，酶切產(chǎn)物進(jìn)行10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分析.然后，參照測序結(jié)果篩選陽性的反義表達(dá)載體.

2 結(jié)果與分析

2．1 草魚Smad4 基因cDNA 全序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

測序結(jié)果顯示:草魚Smad4 cDNA 全長為2 974 bp，開放閱讀框?yàn)? 644 bp(第367～2 010 bp)，編碼547 個氨基酸，其相對分子質(zhì)量為59 690.3，分子式為C2632H4073N753O791S24，理論等電點(diǎn)為6.5，無信號肽和跨膜序列.草魚Smad4 基因含有2 個N-糖基化位點(diǎn)，2 個蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)，4 個酪蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)，9 個N-豆蔻?；稽c(diǎn)和1 個酰胺化位點(diǎn)(圖2).

2．2 草魚與其他生物Smad4 蛋白氨基酸序列的相似性比較和進(jìn)化樹分析

草魚Smad4 氨基酸序列與其他生物的相似性比較高，其全長序列與斑馬魚、鯉、非洲爪蟾Xenopus laevis、小鼠和人的相似性分別達(dá)到了95.61%、94.33%、84.63%、85.77%和85.95%(表1).

圖2 草魚Smad4 基因全長cDNA 序列推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Smad4 gene full-length cDNA sequence-deduced amino acid sequence from grass carp

表1 草魚Smad4 蛋白氨基酸序列相似性比較Tab．1 Homology comparison of Smad4 amino acid sequence from grass carp

用MEGA 軟件構(gòu)建了Smad4 蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3).分析結(jié)果顯示，草魚和鯉魚Smad4 蛋白的親緣關(guān)系比較近.

2．3 Smad4 蛋白疏水性分析

Protscale 軟件的疏水性預(yù)測結(jié)果如圖4 所示，Smad4 蛋白存在6 個高分值(Scare＞1.5)峰，分布在第16～18、473～474、477、480～481、483、497 氨基酸位點(diǎn)，屬于高疏水性域;19 個低分值(Scare＜-1.5)峰，分布在第26～28、45～50、100～101、103～104、106～107、158～164、179、243～245、247、250、255～258、265、267、270、277～285、314、414～415、436～444、510～513 氨基酸位點(diǎn)，屬于高親水性域.

圖3 草魚Smad4 蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of amino acid sequence of Smad4 protein from grass carp

圖4 Smad4 蛋白氨基酸序列的疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity analysis of amino acid sequence of Smad4 protein

2．4 Smad4 蛋白功能結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)特征預(yù)測

用ExPasy 服務(wù)器中的Prosite 工具對Smad4 蛋白進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)2 個結(jié)構(gòu)域(圖5a)，第1 個為MH1 結(jié)構(gòu)域，由第15～139 共125 個氨基酸殘基組成;第2 個是MH2 結(jié)構(gòu)域，由第318～547 共230 個氨基酸殘基組成.

Predict protein 軟件預(yù)測結(jié)果如圖5b 所示，Smad4蛋白二級結(jié)構(gòu)中有5 個α 螺旋結(jié)構(gòu)域，分布在第12～21、30～60、368～378、435～461、525～537 氨基酸區(qū)域;有12 個β-折疊結(jié)構(gòu)域，分布在第69～71、89～95、319～325、333～336、342～345、382～387、392～395、402～405、421～424、430～433、493～502、518～523 氨基酸區(qū)域，其余區(qū)域均為無規(guī)則卷曲域.

圖5 草魚Smad4 蛋白序列二級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析Fig.5 Prediction of domains and secondary structure of Smad4 protein from grass carp

2．5 重組質(zhì)粒構(gòu)建與PCR 檢測和酶切鑒定

以pcDNA3.1(+)-Anti-Smad4 為模板的PCR擴(kuò)增，可見1 條長度約1.6 kb 的目的條帶.將測序結(jié)果與已知的草魚Smad4 基因ORF 序列比對，序列一致，Smad4 片段已經(jīng)成功地反向插入了pcDNA3.1(+)載體.如圖6 所示，pcDNA3.1(+)共由5 428 bp 組成，EcoRⅠ和XhoⅠ分別位于952 和985 bp 處，經(jīng)雙酶切后除去33 bp，再加上新插入的片段1 655 bp，重組載體的長度為7 050 bp.重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Anti-Smad4 經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，可見在1.6 kb 處有1 條目的條帶.

圖6 草魚Smad4 反義真核表達(dá)載體的PCR 檢測和雙酶切鑒定Fig.6 PCR and double enzyme identification of recombinant vector pcDNA3.1(+)-Anti-Smad4 from grass carp

3 討論與結(jié)論

從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果來看，Smad4 基因推導(dǎo)的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹主要分成2 大支:魚類和哺乳類.系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，草魚與鯉、斑馬魚等鯉科魚類具有較近的親緣關(guān)系，其中與鯉的親緣關(guān)系最近.進(jìn)化樹中各個物種Smad4 蛋白的親緣遠(yuǎn)近與各自的分類地位相符合，說明Smad4 蛋白的氨基酸序列具有很高的保守性.相似性比較結(jié)果顯示，草魚Smad4 基因符合Smad4 基因高度保守的特征，與其他魚類相比，氨基酸序列的相似性都在90%以上;與人和小鼠等其他物種相比，氨基酸序列的相似性則達(dá)到了85%左右.草魚Smad4 基因推導(dǎo)的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果和相似性分析都與傳統(tǒng)的魚類分類地位相吻合.

Smads 蛋白非常保守，它們結(jié)構(gòu)相似，均由保守的N 端MH1 結(jié)構(gòu)域［12］、C 端MH2 結(jié)構(gòu)域［13］和富含脯氨酸的連接區(qū)域構(gòu)成.MH1 結(jié)構(gòu)域是Smads 蛋白的1 個DNA 綁定區(qū)域，通過β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)與DNA 結(jié)合，MH2結(jié)構(gòu)域位于Smads 蛋白的C 端，對與I 型受體結(jié)合、磷酸化觸發(fā)、異源低聚物形成及轉(zhuǎn)錄激活等都有作用，對于Smad4 與其他Smad 分子形成低聚物及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄有十分重要的作用.結(jié)構(gòu)域MH1 和MH2 可相互作用，MH2 結(jié)構(gòu)域抑制MH1 結(jié)構(gòu)域的DNA 結(jié)合功能，MH1結(jié)構(gòu)域抑制MH2 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活功能［14］.本試驗(yàn)克隆的草魚Smad4 基因經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)，由它推導(dǎo)的氨基酸序列MH1 結(jié)構(gòu)域位于第15～139 個氨基酸殘基處，MH2 結(jié)構(gòu)域位于318～547 個氨基酸殘基處，中間為連接區(qū)域，是典型的Smads 蛋白結(jié)構(gòu).

已有研究發(fā)現(xiàn)Smad4 蛋白的2 個功能結(jié)構(gòu)域(MH1、MH2)比較保守，而富含脯氨酸的連接區(qū)域是可以進(jìn)行不同剪切的，不同的選擇性剪切可以造成Smads 蛋白的連接區(qū)域長短不同.在非洲爪蟾體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了2 種Smad4 的剪切體，盡管二者在連接區(qū)域存在差異，但是兩端的功能結(jié)構(gòu)域都非常保守［15］，而且2 個剪切體都具有相似的轉(zhuǎn)錄活性［16］，在鯉中也發(fā)現(xiàn)了4 種不同的Smad4 剪切體［12］，它們的MH1 結(jié)構(gòu)域均含有141 個氨基酸殘基，MH2 結(jié)構(gòu)域氨基酸數(shù)量也相差不多.草魚與其他幾個物種的Smad4 氨基酸序列相似性比較顯示，MH1 結(jié)構(gòu)域的相似性極高，與斑馬魚和鯉達(dá)到了100%，MH2 結(jié)構(gòu)域的相似性也很高，除了鯉以外，相似性均在97%以上，而中間連接區(qū)域的相似性則相對較低，除了與斑馬魚和鯉相比在90%以外，與其他幾個物種相比均在60%左右.據(jù)此推測，Smad4 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的保守性可能與MH1 和MH2 這2 個功能結(jié)構(gòu)域的高度保守有關(guān).

Smad4 是TGF-β 信號傳導(dǎo)的中心環(huán)節(jié)，它在分子伴侶TRAP1(TNFR associated protein1，腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1)［17］的作用下與受體激活型Smads 結(jié)合形成異源復(fù)合物，將信號傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)，受體激活型Smad 與Smad4 形成的異源復(fù)合物是由2 個受體激活型Smads 和Smad4 組成的異源三聚體［18］，異源三聚體進(jìn)入細(xì)胞核后通過3種方式作用于靶基因.第1 種是異源三聚體直接與DNA 結(jié)合，Smad4 通過識別靶基因上的5'-AGAC-3'序列，并通過N-端MH1 結(jié)構(gòu)域利用β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)與之結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［19］;第2 種是Smads蛋白通過與其他DNA 結(jié)合因子相互作用而與DNA結(jié)合［20］;第3 種是Smads 蛋白復(fù)合物與非DNA 結(jié)合因子相互作用［16］.根據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果，草魚Smad4蛋白的MH1 結(jié)構(gòu)域也存在2 個β-折疊，具備形成β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的條件，暗示草魚Smad4 蛋白可能與其他物種的Smad4 蛋白一樣具有DNA 結(jié)合功能［19］.

1984年，Lzant 等［21］就發(fā)現(xiàn)反義RNA 具有下調(diào)目的基因表達(dá)的功能.目前，反義基因技術(shù)已在魚類研究中得到了應(yīng)用，Uzbekova 等［22］研究發(fā)現(xiàn)帶重組反義sGnRH(促性腺激素釋放激素)載體的轉(zhuǎn)基因大西洋鮭魚Salmo salar 的sGnRH 表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非轉(zhuǎn)基因魚.有關(guān)魚類的Smad4 反義基因技術(shù)的研究鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)構(gòu)建了草魚反義Smad4 基因真核表達(dá)載體，以探究草魚Smad4 基因在其胚胎發(fā)育等過程中的作用.在構(gòu)建反義真核表達(dá)載體的過程中，本文選擇真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)［23］，載體上人巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的啟動子(CMV)保證重組蛋白高效地表達(dá)［24］，豐富的多克隆位點(diǎn)有助于目的片段的有效插入和擴(kuò)增，牛生長激素poly A 尾巴(BGH pA)能高效地終止轉(zhuǎn)錄［25］，載體上的pUC ori 則保證了載體在大腸埃希菌Escherichia coli 體內(nèi)的增殖和合成.因此，本試驗(yàn)構(gòu)建的草魚反義Smad4 基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Anti-Smad4 可為進(jìn)一步研究草魚Smad4 基因的功能及在胚胎發(fā)育過程的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ).

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