粵東地區(qū)散發(fā)性腎病綜合征患兒NPHS2基因多態(tài)性分析

王憲耀 綦巧雯林浩銓林敏楊立業(yè) 林明祥★

粵東地區(qū)散發(fā)性腎病綜合征患兒NPHS2基因多態(tài)性分析

王憲耀1綦巧雯1林浩銓1林敏2楊立業(yè)2林明祥1★

目的研究粵東地區(qū)散發(fā)性腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）患兒NPHS2基因的多態(tài)性，為早期預(yù)測(cè)該地區(qū)原發(fā)性NS患兒對(duì)常規(guī)激素治療的反應(yīng)性及預(yù)后提供幫助。方法聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因組DNA，直接測(cè)序分析25例散發(fā)性腎病綜合征患兒NPHS2基因的多態(tài)性。結(jié)果25例患兒的NPHS2基因中8個(gè)外顯子均未檢測(cè)出錯(cuò)義突變，在外顯子1，2，8中發(fā)現(xiàn)4個(gè)已報(bào)道的SNP位點(diǎn)（rs1079292；rs3738423；rs1410592；rs3818587）。結(jié)論在已檢測(cè)的25例粵東散發(fā)性腎病綜合征患兒中NPHS2基因未見(jiàn)有編碼區(qū)突變，提示NPHS2突變不是該地區(qū)散發(fā)性腎病綜合征患兒發(fā)病的主要致病原因。

NPHS2；突變；粵東；散發(fā)性；腎病綜合征

散發(fā)性腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）及大量蛋白尿的病因及發(fā)病機(jī)理至今仍未完全明確。研究表明，免疫及遺傳因素可能起著重要的作用。Podocin是2000年才發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于腎小球足細(xì)胞裂孔隔膜處的特征性結(jié)構(gòu)分子[1,2]，其編碼基因NPHS2定位于1q25~31。Podocin表達(dá)的缺失可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳激素抵抗型腎病綜合征，臨床表現(xiàn)為早期出現(xiàn)蛋白尿并迅速發(fā)展為終末期腎病。家族或非家族性激素抵抗型腎病綜合征及局灶節(jié)段腎小球硬化型患者中，目前已有60多種NPHS2基因突變的報(bào)道，包括點(diǎn)突變、缺失、插入、框架漂移及啟動(dòng)子區(qū)突變等[3~7]。對(duì)激素依賴或頻復(fù)發(fā)性NS患兒是否存在NPHS2基因突變目前仍有爭(zhēng)議[7,14,18]。本研究應(yīng)用直接測(cè)序分析了25例粵東散發(fā)性NS患兒NPHS2基因的多態(tài)性現(xiàn)象，擬了解該地區(qū)散發(fā)性NS患兒發(fā)病與NPHS2基因突變的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

以2008年11月~2010年11月在本院住院的25例原發(fā)性NS患兒為研究對(duì)象，其中4例為頻復(fù)發(fā)型，2例為激素耐藥型，其余為激素敏感型。發(fā)病年齡（數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布）中位年齡6歲，年齡最小19個(gè)月，最大13歲，其中男性20例，女性5例。排除有遺傳性疾病家族史、乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴性糖尿病、原發(fā)性高血壓等，以及因藥物、理化因素引起的腎臟病變導(dǎo)致大量蛋白尿患兒。對(duì)照組為正常體檢兒童10例，所有入選者均獲知情同意權(quán)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

留取入選者外周靜脈血2 mL，肝素抗凝。用常規(guī)DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。用PCR體外擴(kuò)增NPHS2共8個(gè)外顯子片段，純化后直接測(cè)序分析其多態(tài)性現(xiàn)象。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與序列

引物設(shè)計(jì)分別位于各外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子區(qū)域（表1）。

1.2.3 PCR反應(yīng)

條件按常規(guī)操作適當(dāng)修改：PCR反應(yīng)體系為50μL，含100 ng基因組DNA模板，5μL 5×PCR緩沖液，4μL 10 mmol/L dNTP，特異性引物各1μL（20μmol/L），Taq DNA多聚酶2.5 U。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)：94℃ 40 s，55℃~58℃（退火溫度根據(jù)引物Tm值加以調(diào)整）40 s（退火時(shí)間根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度加以調(diào)整），72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取10μL PCR產(chǎn)物加入含有0.5 mg/L溴化乙錠的2%瓊脂糖泳槽，100 V電泳30 min，紫外投射燈下觀察。

1.2.4 測(cè)序

PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司直接測(cè)序。

2 結(jié)果

在入組的25例原發(fā)性NS患兒及正常對(duì)照中，檢測(cè)NPHS2基因所有8個(gè)外顯子，均未發(fā)現(xiàn)有錯(cuò)義突變，病例組檢測(cè)到的同義多態(tài)性有位于外顯子1的rs1079292：GG[A/G]，都為純合子G；位于外顯子2的rs3738423：TC[C/T]，雜合3例，其余為純合子C；位于外顯子8中的rs1410592：GC[C/T]，雜合14例，純合子C 5例，純合子T 6例，以及rs3818587：CT[G/A]，其中雜合4例，純合子A 21例（圖1），與正常對(duì)照組等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

NPHS2基因共有8個(gè)外顯子。自2000年以來(lái)，各國(guó)學(xué)者已經(jīng)在多個(gè)家族性、散發(fā)性激素抵抗型腎病綜合征（steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS）及局灶節(jié)段腎小球硬化型（focal and segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）病例中發(fā)現(xiàn)了60種以上的突變。這些突變散發(fā)于NPHS2基因的8個(gè)外顯子之中，并未發(fā)現(xiàn)特別的熱點(diǎn)突變?；颊叽蠖嘣趦和诎l(fā)病，也有在成人期發(fā)病。余自華等[8]曾報(bào)道，在23例散發(fā)SRNS兒童中發(fā)現(xiàn)1例NPHS2基因1082T>C雜合（外顯子2，L351P）突變的患者，病理診斷為FSGS，后死于腎功能衰竭。

目前國(guó)內(nèi)外研究所報(bào)道的NPHS2基因的突變主要是單核苷酸置換所引起的錯(cuò)義突變，大片段的缺失、插入等嚴(yán)重的突變很少看到。而且這些錯(cuò)義突變主要是純合子，或者是復(fù)雜的雜合子，即在一個(gè)患者的基因中存在兩種或以上的錯(cuò)義突變。一般而言，預(yù)后也比較差。歐洲及北美的研究發(fā)現(xiàn)，在家族性SRNS和非家族性SRNS病例中，攜NPHS2基因純合及復(fù)雜雜合子突變的分別占到38%和26%[9,10]。這些患者往往發(fā)病比較早，但腎移植之后的復(fù)發(fā)率比較低。Ruf等[11]報(bào)道，在26例攜帶NPHS2基因復(fù)雜雜合突變的（雙突變）的NS病例中，22例對(duì)激素抵抗，11例出現(xiàn)ESRD（end stage renal disease）；而9例單純雜合突變的NS病例中，4例表現(xiàn)為激素敏感，只有1例發(fā)病8年后進(jìn)展為終末期腎衰。Malina M等[12]報(bào)道在1例純合R138Q突變SRNS幼兒，環(huán)孢素A治療獲得部分緩解。對(duì)于僅有1個(gè)單純雜合錯(cuò)義突變的病例，其引起NPHS2基因功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿和激素抵抗型腎病綜合征的發(fā)生機(jī)制，目前尚有爭(zhēng)議。Liu等[13,14]曾報(bào)道，應(yīng)用體外人工誘變技術(shù)建立NPHS1基因突變轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜表面nephrin的表達(dá)消失了，或有明顯的下調(diào)，而胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)有顯著的nephrin蛋白表達(dá)。說(shuō)明這些點(diǎn)突變?cè)谝鹨粋€(gè)氨基酸殘基置換之后，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)如折疊的異常，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能正常轉(zhuǎn)運(yùn)至生理位置，滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等蛋白質(zhì)的合成之處，從而引發(fā)蛋白質(zhì)功能的喪失和缺陷。

表1 NPHS2基因8個(gè)外顯子區(qū)域?qū)?yīng)引物序列Table 1 The primer sequences of 8 NPHS2 exons

圖1 檢測(cè)到的NPHS2基因SNP多態(tài)性Figure 1 Polymorphisms of SNPs detected in NPHS2(①②:位于外顯子2的rs3738423: TC[C/T]，雜合3例，其余為純合子C；③④⑤：位于外顯子8中的rs1410592：GC[C/T]，雜合14例，純合子C 5例，純合子T 6例；⑥⑦：位于外顯子8中的rs3818587：CT[G/A]，雜合4例，純合子A 21例）

盡管多個(gè)研究已證實(shí)NPHS2基因純合或復(fù)合雜合突變導(dǎo)致SRNS，但是對(duì)NPHS2基因突變是否參與激素依賴型或頻復(fù)發(fā)型腎病綜合征（steroiddependent nephrotic syndrome/frequent relapse nephrotic syndrome，SDNS/FRNS）發(fā)病仍有不同的認(rèn)識(shí)。Caridi等[7]對(duì)59例SDNS/FRNS患兒進(jìn)行NPHS2基因突變分析，結(jié)果4例（6.8%）患兒檢測(cè)到NPHS2基因雜合突變，認(rèn)為NPHS2基因雜合突變與原發(fā)性NS發(fā)生激素依賴或頻復(fù)發(fā)有關(guān)。而Gbadegesin等[15]研究未能證實(shí)NPSH2基因雜合突變與SDNS/FRNS相關(guān)。他們應(yīng)用DNA直接測(cè)序法對(duì)20例SDNS/FRNS患兒進(jìn)行NPHS2基因突變分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)患兒存在NPHS2基因突變。

NPHS2基因突變介導(dǎo)的家族性SRNS應(yīng)該具有地域差異。與歐洲報(bào)道的較高發(fā)病率不同，Abid A等[16]報(bào)道在145例巴基斯坦NS患者中（其中36例為先天或嬰兒NS，39例為家族性NS），只有3.4%存在NPHS2突變，其中，家族性NS中未發(fā)現(xiàn)有突變。付榮等[17]在對(duì)3個(gè)南方漢族人家族性SRNS家系中NPHS2基因8個(gè)外顯子及啟動(dòng)子檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)其不是主要致病原因。Chernin G等[18,19]對(duì)18例SRNS非裔美籍兒童NPHS2基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)未存在致病性突變，這與其他報(bào)道的接近30%~40%突變率不同。Cho H Y等[20]報(bào)道在70例SRNS韓國(guó)患兒中未檢測(cè)出NPHS2突變。本研究在25例散發(fā)的兒童腎病綜合征患者中，未發(fā)現(xiàn)引起蛋白表達(dá)異常的錯(cuò)義突變，但在外顯子1、外顯子2、外顯子8中存在多態(tài)性。在IgA腎病患者，NPHS1基因的多態(tài)變化與患者的蛋白尿等表型的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示這樣的多態(tài)性可能通過(guò)目前我們尚未明確的機(jī)制，影響該基因的功能。本研究中存在的多態(tài)性因入組數(shù)較少，是否具有潛在病理意義還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

在本研究中的粵東地區(qū)散發(fā)性NS患兒中，其NPHS2基因未存在引起蛋白編碼改變的錯(cuò)義突變，提示在該地區(qū)散發(fā)性NS患兒，特別是激素敏感型NS患兒，NPHS2突變致nephrin表達(dá)異常不是其主要發(fā)病原因，在發(fā)現(xiàn)的數(shù)個(gè)NPHS2多態(tài)性中是否存在病理意義仍須進(jìn)一步研究。

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Polymorphisms of NPHS2 gene in sporadic nephrotic syndrome children of eastern Guangdong

WANG Xianyao1, QI Qiaowen1, LIN Haoquan1, LIN Min2, YANG Liye2, LIN Mingxiang1★
(1.Department of Pediatrics, Shantou Central Hospital, Guangdong, Shantou 515000, China; 2.Central Laboratory, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, Chaozhou 521000, China)

Objective To study the polymorphisms of podocin coding NPHS2 gene in sporadic primary nephrotic syndrome (NS) children of eastern Guangdong in order to predict the responsiveness of steroid therapy and prognosis. Methods Genome DNA was amplif i ed by PCR. Polymorphisms of NPHS2 gene in 25 sporadic nephrotic syndrome children were examined by direct sequencing. Results There was no missense mutation being detected in exons 1~8 of NPHS2 in 25 sporadic NS children. Four polymorphisms (rs1079292; rs3738423; rs1410592; rs3818587) were detected among exon 1, 2, 8. Conclusion In 25 sporadic NS children of eastern Guangdong there was no missense mutation being detected in coding domain sequence, which indicated that mutation of NPHS2 was not the primary pathogeny of sporadic nephrotic syndrome children in eastern Guangdong.

NPHS2; Mutation; Eastern Guangdong; Sporadic; Nephrotic syndrome

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（B2010298）

1.汕頭市中心醫(yī)院兒科，廣東，汕頭 515000 2.潮州市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東，潮州 521000

★通訊作者：林明祥，E-mail: mingxlin@sina.com