改良碘化鉀法提取凍存外周血基因組DNA的方法探討

蔡雪梅 李穗雯 胡大春

改良碘化鉀法提取凍存外周血基因組DNA的方法探討

蔡雪梅 李穗雯 胡大春★

目的探討用改良碘化鉀法（改良法）提取長(zhǎng)期凍存外周血基因組DNA的方法。方法對(duì)碘化鉀（KI）法加以改良，包括：血量由100 μL增加到200 μL；使用0.9% NH4CL溶液代替無菌重蒸餾水裂解紅細(xì)胞；增加裂解白細(xì)胞膜的5 mol/L KI溶液的用量（為70 μL）；低溫（4℃）離心。然后用改良碘化鉀法從82份-80℃凍存外周血標(biāo)本中提取基因組DNA。同時(shí)使用碘化鉀法提取其中的30份血標(biāo)本，比對(duì)兩種方法提取DNA的濃度和純度，并進(jìn)行CYP2C19相關(guān)基因PCR擴(kuò)增。結(jié)果兩種方法所提取的DNA濃度和純度分別是碘化鉀法為128.2±34.9 μg/mL和A260/A2801.74±0.08，改良法為220±91.29 μg/mL和A260/A2801.87±0.12。改良法獲得的DNA純度更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），通過增加樣本量及對(duì)方法進(jìn)行改良獲得的DNA量較多。對(duì)改良后方法提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果穩(wěn)定。結(jié)論改良碘化鉀法從長(zhǎng)期凍存外周血中所提取的基因組DNA質(zhì)量較高，能夠滿足對(duì)臨床凍存樣本研究的需求。

基因組DNA；碘化鉀法；改良法；外周血

隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，很多疾病的研究都集中到基因水平上，基因組DNA的提取成為首要問題。目前提取基因組DNA的方法比較多，有傳統(tǒng)的蛋白酶K消化法、尿素提取法、酚/氯仿提取法、碘化鈉法、碘化鉀法[1~2]以及較先進(jìn)的自動(dòng)化提取法[3~4]等。其中碘化鉀法抽提外周血基因組DNA具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)，但從長(zhǎng)期凍存血樣中獲取DNA其純度相對(duì)較差，難以滿足對(duì)DNA純度要求較高的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[5~6]。而實(shí)際研究過程中，大量臨床血樣收集后需要凍存，以便分批進(jìn)行基因組DNA提取。如何從長(zhǎng)期凍存外周血中提取具有較高濃度和純度的基因組DNA，是后續(xù)試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。本文對(duì)常規(guī)碘化鉀法[7]進(jìn)行改良，并應(yīng)用于82份-80℃長(zhǎng)期凍存外周血樣本的DNA提取和分析，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器：SHATOS高速冷凍離心機(jī)、eppendorf紫外分光光度計(jì)、Bio-Rad thermal cycler擴(kuò)增儀、Bio-Rad Power/Pac3000電泳儀、Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)?；瘜W(xué)試劑：氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇等，均為分析純。

1.2 血液標(biāo)本來源及保存

82例全血標(biāo)本來源于昆明地區(qū)彝族志愿者（具有知情同意權(quán)），EDTA-K2抗凝，充分混勻后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 改良碘化鉀法

基于文獻(xiàn)[7]的碘化鉀法進(jìn)行部分改良：血量由100μL增加到200μL；使用0.9% NH4CL溶液代替無菌重蒸餾水裂解紅細(xì)胞；增加用以裂解白細(xì)胞膜的5 mol/L KI溶液用量，由20μL增加到70μL；離心均在低溫（4℃）下進(jìn)行。操作步驟如下：①取EDTA-K2抗凝血200μL加入到預(yù)先加有1.0 mL 0.9% NH4CL溶液的1.5 mL Eppendorf管中，并混勻，靜置10 min至清亮后低溫4℃12000 r/min離心5 min，棄上清，再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟一次；②取沉淀加5 mol/L KI溶液70μL，旋渦振蕩充分混合30 s；再依次加入0.9% NaCl溶液300μL、氯仿-異戊醇（24:1）混合液450μL，振蕩混合1 min后，12000 r/min低溫4℃離心5 min，然后吸取水相層，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5 mL Eppendorf管中；③加異丙醇180μL，輕輕混勻，12000 r/min低溫4℃離心5 min，棄上清；④加無水乙醇1.0 mL，12000 r/min低溫4℃離心5 min，棄去無水乙醇；⑤待干后加20μL TE使其溶解，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA的電泳分析、濃度及純度鑒定

1.4.1 兩種方法提取基因組DNA的電泳分析

取提取的DNA樣品5μL，加6×Loading Dye上樣緩沖液2μL混勻，0.8 %瓊脂糖凝膠130 V電壓條件下電泳30 min，在紫外燈下觀察結(jié)果，用凝膠成像分析系統(tǒng)拍攝成像。

1.4.2 DNA濃度及純度分析

取DNA提取物5μL，加95μL超純水稀釋，超純水調(diào)零后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的基因組DNA在波長(zhǎng)260、280 nm的OD值，計(jì)算DNA濃度、純度。

1.4.3 CYP2C19相關(guān)基因PCR擴(kuò)增

對(duì)用改良法提取的82例凍存外周血基因組DNA進(jìn)行CYP2C19相關(guān)基因PCR擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8~9]設(shè)計(jì)引物，通過NCBI-BLAST比對(duì)后,由上海生物工程有限公司合成：正向引物，5'-CAACCAGAGCTTGGCATATTG-3'；反向引物，5'-TCACAAATACGCAAGCAGTCA-3'，PCR擴(kuò)增目的片段為301 bp。PCR反應(yīng)體系50μL中加DNA模板1μL。PCR循環(huán)參數(shù)[10~11]：預(yù)變性 94℃ 3 min；94℃變性 30 s，58℃退火30 s，延伸72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7 min一個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增條帶是否與預(yù)計(jì)片段大小一致。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，DNA純度比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法提取DNA的電泳分析結(jié)果

同一樣本用常規(guī)碘化鉀法[7]和改良碘化鉀法提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：改良碘化鉀法點(diǎn)樣附近有一致密條帶，結(jié)果滿意（圖1）。

2.2 DNA的濃度及純度

用碘化鉀法[7]和改良碘化鉀法從30份凍存-80℃外周血抽取基因組DNA，其濃度和純度分別為碘化鉀法128.2±34.9μg/mL和A260/A2801.74±0.08，改良碘化鉀法為220±91.29μg/mL和A260/A2801.87±0.12，改良碘化鉀法通過增加樣本量獲得的DNA量相對(duì)多；比較兩種方法提取DNA的純度，經(jīng)t檢驗(yàn)，t=5.698，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 CYP2C19相關(guān)基因PCR擴(kuò)增

以原有碘化鉀和改良碘化鉀法提取同一樣本的DNA為模板進(jìn)行CYP2C19相關(guān)基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)一條301 bp大小的DNA條帶，與預(yù)期的CYP2C19相關(guān)基因片段的大小一致。兩方法結(jié)果顯示比較，改良碘化鉀法與原有碘化鉀法均可獲得較為穩(wěn)定滿意的條帶（如圖2和圖3）。

3 討論

本研究將常規(guī)碘化鉀法[7]稍加改良，其中有：破壞紅細(xì)胞采用0.9% NH4CL溶液，由于溶液呈弱酸性，能比較溫和地溶解破壞紅細(xì)胞，對(duì)白細(xì)胞起到相對(duì)保護(hù)作用；將原方法中用無菌重蒸餾水500μL使用一次，改為0.9% NH4CL溶液1.0 mL且重復(fù)二次，使紅細(xì)胞溶解得更加完全，有利于保障DNA的純度，避免血紅蛋白對(duì)PCR擴(kuò)增的干擾；血量由100μL增加到200μL，使單位體積內(nèi)白細(xì)胞數(shù)相對(duì)增加而提高DNA的產(chǎn)量；同時(shí)增加高濃度KI的用量，可使碘化鉀溶液在短時(shí)間內(nèi)直接裂解白細(xì)胞膜、核膜，完全充分，使DNA釋放出來。在低溫（4℃）下離心，盡可能使DNA不被破壞以保證其完整性。通過常規(guī)沉淀、洗滌，即可完成基因組DNA的提取。

圖1 兩種方法提取DNA的電泳分析結(jié)果Figure 1 Electrophoretic analysis of the two methods of extracting DNA

圖2 原有KI法提取凍存外周血DNA的PCR結(jié)果Figure 2 PCR results of frozen blood DNA extracted by KI method

圖3 改良KI法提取凍存外周血DNA的PCR結(jié)果Figure 3 PCR results of frozen blood DNA extracted by the modif i ed KI method

通過對(duì)改良前后方法的比對(duì)，結(jié)果顯示改良后方法提取的DNA純度優(yōu)于改良前方法。用改良后方法提取的DNA作為模板，進(jìn)行CYP2C19相關(guān)基因PCR擴(kuò)增，獲得滿意結(jié)果（圖3）。提示改良碘化鉀法能從凍存外周血中提取出質(zhì)量較高DNA分子。此改良法所用試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑，價(jià)格便宜，配制簡(jiǎn)便，且方法易于掌握，重復(fù)性好，能較好滿足樣本數(shù)量大的臨床研究需求。

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A improved method for extracting genomic DNA from reserved blood

CAI Xuemei, LI Suiwei, HU Dachun★
(GanMei Hospital of Kunming Medical University, The Clinical Disease Molecular Biology Laboratory of Kunming, Yunnan, Kunming 650011, China)

Objective To explore the modif i ed potassium iodide method (Improved method) for extracting the long-term cryopreservation of peripheral blood genomic DNA. Methods The potassium iodide (KI) method was improved by increasing the blood volume from 100μL to 200μL, replacing the sterile distilled water with 0.9% NH4CL solution for destruction the red blood cells, increasing the 5 mol/L KI solution dosage(70μL) for cracking the white cells membrane, and centrifuging at low temperature(4℃). The modif i ed potassium iodide method was used for extracting the genomic DNA from 82 blood samples reserved in -80℃, and the concentration and purity of the extracted DNA was compared with the KI method. Meanwhile the extracted DNA was used as the template to amplify CYP2C19 gene by PCR. Results The extracted DNA concentration and A260/A280of the KI method and the improved method were 128.2±34.9μg/mL, 1.74±0.08 and 220±91.29μg/mL, 1.87±0.12, respectively. The DNA purity of improved method was higher, and there were signif i cant statistically different (P<0.01). The amount of DNA extracted by the modif i ed method was more than that of KI method. The genomic DNA extracted by improved method were amplif i ed using PCR, which result were stable. Conclusion The genomic DNA extracted from the long-term cryopreservation of peripheral blood using improved KI method had higher quality, which were able to meet the demand on the clinical study of cryopreserved samples.

Genomic DNA; Potassium iodide method; Improved method; Peripheral blood

昆明醫(yī)科大附屬甘美醫(yī)院，昆明市臨床疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南，昆明 650011

★通訊作者：胡大春，E-mail:hudach@163.net