HPV分型及高危八型定量檢測在宮頸病變中的意義

趙穎 林敏潘美晨 楊禮蔡應木★

HPV分型及高危八型定量檢測在宮頸病變中的意義

趙穎1林敏2潘美晨1楊禮1蔡應木1★

目的分析宮頸病變中的人乳頭瘤病毒的亞型分布及病毒載量的情況，以及其與宮頸疾病進展的關(guān)系。方法潮州中心醫(yī)院就診的220例液基細胞學檢查異常的患者行陰道鏡檢查及組織病理學檢查。收集宮頸脫落細胞標本，運用HybriMax導流雜交技術(shù)檢測HPV的21個亞型，運用實時熒光PCR定量檢測八個高危亞型的病毒載量。結(jié)果220例樣本中，HPV感染率為87.3%，其中HPV16是最主要的基因型（50.91%），隨著宮頸病變程度的增高，總HPV感染率和HPV16感染率逐漸升高。HPV58，HPV33，HPV52，HPV31和HPV18是僅次于HPV16的五種基因亞型，其檢出率分別為22.73%，11.82%，11.36%，5.9%和4.54%。高危HPV亞型的病毒載量與宮頸病變的嚴重程度呈正相關(guān)（r=0.373，P<0.001）。結(jié)論盡管HPV52和HPV58是該地區(qū)HPV感染的主導亞型，但在宮頸病變患者中HPV感染以HPV16為主，而與宮頸癌最相關(guān)的是HPV16和HPV18。病毒載量是一個潛在的確定子宮頸癌及癌前病變的輔助指標。

高危型人乳頭瘤病毒；宮頸上皮內(nèi)瘤變；實時熒光定量PCR

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。人類乳頭狀瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染被證實是宮頸癌發(fā)生的必要原因，幾乎100%的宮頸癌中能檢測到HPV感染。然而大多數(shù)婦女的HPV感染呈自限性，經(jīng)過1~2年，HPV感染能夠被機體清除。因此，怎樣識別持續(xù)性感染并評估其發(fā)展成為高度上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）或?qū)m頸癌的風險是宮頸癌預防和篩查的一個亟需解決的難題。

本研究通過對宮頸病變中不同階段患者的宮頸脫落細胞進行HPV亞型檢測和HPV高危八型定量測定，確定各級宮頸病變中HPV感染的亞型分布和病毒載量情況，探討HPV亞型和HPV病毒載量在宮頸病變發(fā)展中的作用以及意義。

1 資料和方法

1.1 資料

在潮州中心醫(yī)院就診行液基細胞學檢查（TCT）者，采用TBS分類法，結(jié)果異常的220位患者。年齡范圍18至64歲，平均年齡40.6歲。

1.2 研究方法

220例患者均行電子陰道鏡檢查和宮頸活檢及HPV亞型檢測和高危八型的病毒載量測定。

1.2.1 陰道鏡檢查以及病理活檢

嚴格按照操作說明進行電子陰道鏡檢查，對可疑部位活檢或同時行宮頸管搔刮術(shù)；陰道鏡活檢標本病理學檢查由潮州市中心醫(yī)院病理科醫(yī)師完成。

1.2.2 HPV-DNA分型測定

用宮頸脫落細胞采集器于宮頸口采集表皮脫落細胞，運用凱普提取試劑盒按說明書嚴格操作提取DNA，采用MY09/MY11 L1通用引物擴增40個循環(huán)，運用凱普HybriMax導流雜交和基因芯片進行HPV基因亞型檢測。

1.2.3 高危HPV定量測定

經(jīng)提取的DNA樣本，應用中山大學達安基因股份有限公司的人乳頭瘤病毒高危八型（16、18、31、33、45、52、56、58）引物在Roche-Lightcycler 480上對E6/E7片段進行擴增，通過環(huán)閾值的大小以及擴增效率計算樣本的原始拷貝數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，以組織病理學檢查結(jié)果作為金標準，將220個樣本分為五個病理組。組間感染率比較采用卡方檢驗，組間的年齡均數(shù)比較采用方差分析。病毒載量與病理分級采用spearman相關(guān)性分析，經(jīng)log轉(zhuǎn)換后的病毒載量采用方差檢驗，年齡分組之間的病毒載量以及單純感染和多重感染病毒載量以及病理分級的比較均采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05則認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病理檢查結(jié)果

220位患者中，經(jīng)陰道鏡活檢病理結(jié)果為慢性宮頸炎的患者32例、CIN1的患者60例、CIN2的患者60例、CIN3的患者32例、宮頸癌的患者36例。各病理組中年齡、HPV16檢出率、總的HPV檢出率、高危八型檢出率以及病毒載量的分布見表1。

2.2 HPV亞型檢測

在220例樣本中，HPV感染192例（87.3%），包括18種基因亞型，其中HPV16是檢出率最高的亞型（50.91%，112/220），且隨著宮頸病變程度的增加，檢出率逐漸增高。HPV58、HPV33、HPV52是僅次于HPV16的三個亞型，檢出率分別為22.73%、11.82%、11.36%，在不同宮頸病變中感染率沒有太大變化（圖1）。HPV18型與宮頸癌的相關(guān)性僅次于HPV16亞型，在我們的研究中檢出率僅4.54%，排第六。其他高危亞型（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）分布詳見表2。

圖1 HPV16、HPV58、HPV33和HPV52在各個病理組中檢出率的分布Figure 1 The distribution of the detection rates of HPV16, HPV58, HPV33 and HPV52 in each pathological group

192例HPV感染者中，63例檢出兩個或者兩個以上的亞型，占總HPV感染的32.81%，其中三種最常見的多重感染模式分別為HPV16和HPV58，HPV16和HPV33，HPV16和HPV52。

2.3 病毒載量

通過實時熒光定量PCR檢測，220例檢測對象中182個樣本檢測為陽性，其中最小病毒載量為1.13拷貝/mL，最大為5.09×106拷貝/mL，八個高危型HPV檢出率與HPV分型的檢出率基本一致（表1）。由于該PCR反應的線性范圍為500~1×106拷貝/mL，我們將病毒載量小于500拷貝/mL的可疑陽性分為陰性組，并分陰性、低病毒載量和高病毒載量三個組與病理分級進行相關(guān)性分析。五個病理組間病毒載量具有顯著差異，隨著宮頸病變嚴重程度的增高，病毒載量逐漸升高（表3），但相鄰病理組間存在重疊（圖2）。經(jīng)兩兩比較，宮頸癌組要顯著高于慢性宮頸炎組和CIN1組（P<0.005）。

年齡分組中，年紀大于35歲的婦女的病毒載量要明顯高于年齡小于35歲的婦女。而單純感染和多重感染之間的病毒載量沒有明顯區(qū)別。

3 討論

HPV是屬于乳頭瘤病毒科的一種微小雙鏈DNA病毒，對皮膚和粘膜上皮均能造成感染，其感染具有種屬特異性。已經(jīng)證實HPV是宮頸癌發(fā)生的必要原因，幾乎100%的宮頸癌中能夠檢出HPV感染[2]。

圖2 log轉(zhuǎn)換后的病毒載量在各個病理組中的分布Figure 2 The distribution of viral load after log conversion in various pathological groups

表1 年齡、HPV16檢出率、HPV檢出率、高危八型檢出率和原始拷貝數(shù)在各病理組中的分布Table 1 The distribution of age, the HPV16 infection rates, the HPV infection rates, the HR-HPV infection rates and viral load in each pathological group

表2 各病理組HR-HPV基因型的分布 [n/(%)]Table 2 The distribution of HR-HPV genotypes in each pathological group [n/(%)]

表3 病毒載量與宮頸病變嚴重程度的相關(guān)性分析Table 3 Analysis of the association of viral load with the severity of cervical lesion

在本研究中，有87.3%（192/220）的人被檢出HPV感染，隨著病理程度的增加，HPV陽性率逐漸升高，在宮頸癌中最高，達94.44%，與之前的報道一致[3]。HPV16是宮頸癌中最常見的亞型，也被認為是宮頸癌和癌前病變相關(guān)的致癌性最強的亞型[4]。我們的研究中，HPV16共檢出112例（50.91%），且隨著病理程度加重，HPV16的檢出率逐漸增高，在宮頸癌組最高（83.3%），而且無論是單純感染還是多重感染，HPV16都是主導亞型。這與世界相關(guān)研究結(jié)果一致[5,6]，表明HPV16在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

HPV52和HPV58是亞洲特有的兩個基因亞型，在中國、日本等亞洲國家有較高的檢出，而在世界其他地區(qū)很少或者沒有檢出。HPV58在全國范圍內(nèi)都有較高的檢出，而HPV52在中國東南沿海地區(qū)譬如浙江、福建、臺灣、香港以及廣東一些地區(qū)的人群中具有較高的感染率[7,8,9]。之前在潮州進行的兩項流行病學調(diào)查顯示HPV52在該地區(qū)具有絕對優(yōu)勢[10,11]，其檢出率要高于HPV16和HPV58。而在我們的研究中，HPV52檢出率僅11.36%，遠低于此前對潮州的報道，這可能是由于目標人群的差異導致結(jié)果不同。之前還有研究顯示HPV52在癌前病變的感染中高度流行，但很少在浸潤性宮頸癌中檢出[6]。我們的研究結(jié)果為，HPV52的整體檢出率不低，但在宮頸癌中僅檢出5.56%，遠低于HPV16。體外實驗證實，HPV52的E6和E7基因體外轉(zhuǎn)換能力有限，在宮頸癌中很少能結(jié)合到宿主基因而導致無限增值[12]。這表明雖然HPV52在潮州地區(qū)人群中具有較高的流行優(yōu)勢，在癌前病變中的檢出率不低，但是其致癌性相對較弱。

HPV58同樣是潮州地區(qū)一個高流行的亞型，已有研究顯示HPV58次于HPV52排第二位或者第三位[10,11]。我們的此項研究中，檢出率達22.7%（50/220），排第二，僅次于HPV16，與相關(guān)研究一致。HPV18是宮頸癌相關(guān)的主要亞型之一，在世界范圍內(nèi)皆有較高的檢出，本研究中HPV18檢出率較低（4.54%），但是在宮頸癌中的檢出僅次于HPV16，高于HPV52和HPV58。中國的大部分研究顯示宮頸癌中HPV18的檢出率僅次于HPV16。盡管HPV52和HPV58在潮州地區(qū)的HPV感染中占優(yōu)勢，但HPV16仍然是對宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展最重要的亞型，而HPV18雖然檢出率相對較低，但在宮頸癌中僅次于HPV16，因此HPV18同樣是宮頸癌相關(guān)的最重要的亞型之一。同時，HPV58和HPV52作為該地區(qū)的優(yōu)勢，其在潮州地區(qū)HPV感染中具有顯著優(yōu)勢，因此在潮州地區(qū)宮頸癌的防治以及癌前病變的篩查中仍然具有舉足輕重的作用，如果第二代疫苗能覆蓋HPV52和HPV58這兩個特殊亞型，則能夠顯著提高該地區(qū)疫苗的覆蓋率。

細胞學檢查作為篩查手段已經(jīng)使子宮頸癌的發(fā)病率大幅下降，而HPV亞型測定作為一個細胞學檢查附屬的篩查方法使宮頸病變的早期篩查更敏感更有效率。但無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，宮頸癌仍然是一個重大的經(jīng)濟負擔，對于HPV感染的監(jiān)測和管理依舊存有許多困惑。病毒載量作為衡量病毒感染嚴重程度一個指標，一直被認為是可以作為確認CIN的嚴重程度以及評估發(fā)展為子宮頸癌的風險的潛在指標。許多研究表明，高病毒載量與宮頸病變的嚴重程度正相關(guān)[13,14]，在指導ASCUS陰道鏡的運用方面具有重要的意義，能避免一些過度的侵入性檢查，尤其是HPV16。部分研究認為HPV16的病毒載量可以評估婦女進展為宮頸癌的風險或者提示一個較為良好的預后[15,16]。但也有研究者認為病毒載量在識別婦女是否具有進展更高級別宮頸病變或者癌變趨勢的作用有限，HPV感染過程中其他因素可能促進疾病的進展[17,18]。年齡和多重感染是與子宮頸癌和HPV感染相關(guān)的危險因素。本研究結(jié)果顯示，隨著年齡的增長，HPV感染率逐漸升高，而年齡超過35歲的婦女的病毒載量比35歲以下的婦女中的病毒載量高。隨著年齡的增加HPV感染的清除率減低[19]，這也許可以解釋年齡較大的婦女中HPV感染率和病毒載量較高的原因。而多重感染在我們的研究中占所有HPV感染的32.81%，高于之前報道的24.01%以及中國整體的多重感染率28.98%[20]。

綜合本研究表明，病毒載量與CIN以及子宮頸癌的嚴重程度呈正相關(guān)，隨著宮頸病變嚴重程度的增加病毒載量逐漸升高。在病理組間，HR-HPV的病毒載量有交叉重疊，雖然無法直接表明宮頸病變的嚴重程度，但高病毒載量仍然提示HPV感染的婦女進展為宮頸癌的風險較高，因此高危八型病毒載量仍然是一個潛在的確定子宮頸癌及癌前病變的輔助指標。

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The detection of HPV genotyping and viral load of eight high risk human papillomavirus in cervical lesions

ZHAO Ying1, LIN Min2, PAN Meichen1, YANG Li1, CAI Yingmu1★
(1.Shantou University Medical College, Guangdong, Shantou 515041, China; 2.Central Laboratory, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, Chaozhou 521021, China)

Objective The aim of this study is to determine the prevalence and distribution of HPV infection with cervical neoplasia in Chaozhou area and evaluate the association between the viral load of eight high risk human papillomavirus and risk of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical cancer. Methods 220 cases of abnormal liquid-based cytology women from Chaozhou central hospital were examinated with colposcopy and histopathological. Cervical specimens were tested for 21 HPV types using a MY09/MY11 L1 consensus primer PCR method with specif i c dot blot hybridization and viral load of eight high risk genotypes were tested by real-time PCR. Results Overall HPV infection prevalence was 87.3%(192/220) and HPV16 was the most prevalent genotype with a detection rate of 50.9% in our study. The detection rates of HPV and HPV16 raised with increasing of severity of cervical disease (P<0.05). HPV58, HPV33, HPV52, HPV31 and HPV18 were the fi ve most popular genotypes just less than HPV16 with detection rates of 22.73%, 11.82%, 11.36%, 5.9% and 4.54%, respectively. The viral load of high risk HPV was positive correlate with the severity of CIN and cervical cancer(r=0.373, P<0.001). Conclusion Although HPV52 and HPV58 were the advantage genotypes of HPV infection in Chaozhou region, HPV16 was the main genotype of HPV infection in women with cervical lesion in this area, and the most related to cervical cancer were HPV16 and HPV18. The viral load of eight high risk human papillomavirus was a potential auxiliary indicators of cervical cancer and precancerous.

High-risk human papillomavirus (HR-HPV); Cervical intraepithelial neoplasia (CIN); Real-time fl uorescence quantitative PCR (RT-PCR).

廣東省自然科學基金（s212010009081）

1.汕頭大學醫(yī)學院，廣東，汕頭 515041 2.潮州市中心醫(yī)院中心實驗室，廣東，潮州 521021

★通訊作者：蔡應木，E-mail:yingmu_cai@yahoo.com