內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下植入緩釋吉西他濱進(jìn)行胰腺組織間化療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

李瑜斐 孫思予 葛 楠 王樹朋

（沈陽(yáng)市紅十字會(huì)醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110013）

內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下植入緩釋吉西他濱進(jìn)行胰腺組織間化療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

李瑜斐 孫思予 葛 楠 王樹朋

（沈陽(yáng)市紅十字會(huì)醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110013）

目的探尋超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的緩釋吉西他濱組織間化療在豬的胰腺的安全性和可行性。方法在超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下將19G穿刺針刺入豬的胰腺組織中，通過(guò)穿刺針將能夠緩慢釋放吉西他濱的化療粒子植入至胰腺組織的特定位置。觀察14d后，處死動(dòng)物取出放置粒子部位的胰腺組織進(jìn)行觀察。結(jié)果所有化療粒子都被成功植入，沒有粒子發(fā)生移位。胰腺組織發(fā)生局限的纖維素樣壞死區(qū)域。在病灶中心1cm的范圍內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量增多。結(jié)論超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下植入吉西他濱用于胰腺的組織間化療不僅安全、耐受性好，而且可使組織消融、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

胰腺；內(nèi)鏡超聲；化學(xué)療法；吉西他濱

胰腺癌是一種惡性程度非常高的腫瘤，預(yù)后較差，5年生存率僅為5%或更低[1]，絕大多數(shù)的患者在就診時(shí)已失去手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。對(duì)大多數(shù)手術(shù)不能切除的局部晚期胰腺癌，目前主要的治療方法有各種體內(nèi)、體外放療和以吉西他濱為主的化療。由于胰腺的血供復(fù)雜，大多數(shù)胰腺腫瘤具有低血供的特點(diǎn)，胰腺癌全身化療效果不甚理想。為了提高實(shí)體性腫瘤內(nèi)的藥物濃度，減少化療藥物的全身毒性，瘤內(nèi)直接注射化療藥物的給藥方法應(yīng)運(yùn)而生。20世紀(jì)90年代將這種治療方法命名為組織間化療[2]，即把化療藥物和載體組成的混合物植入腫瘤內(nèi)部，在體內(nèi)緩慢釋放，使化療藥物在局部形成有效的治療濃度，減少全身用藥的不良反應(yīng)，且在頭頸部、皮膚等惡性腫瘤的治療中取得了很好的臨床效果。由于胰腺為腹膜后器官，穿刺植入困難，內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下穿刺技術(shù)具有定位準(zhǔn)確、創(chuàng)傷小、穿刺距離短等優(yōu)點(diǎn)，因此可借助內(nèi)鏡超聲進(jìn)行化療粒子的胰腺腫瘤內(nèi)植入治療。孫思予曾在國(guó)內(nèi)外最早進(jìn)行了EUS引導(dǎo)下組織間化療的預(yù)實(shí)驗(yàn)，即在EUS引導(dǎo)下將緩釋5-FU粒子植入豬胰腺內(nèi)，觀察粒子局部胰腺組織病理學(xué)變化及生長(zhǎng)代謝變化，證實(shí)了EUS引導(dǎo)下組織間化療的準(zhǔn)確性、安全性和組織消融的有效性。經(jīng)研究在生存期和臨床獲益率方面，吉西他濱均明顯優(yōu)于5-Fu。能否EUS植入目前對(duì)胰腺癌療效最佳的治療藥物吉西他濱做成緩釋多聚粒子來(lái)進(jìn)行組織間治療？因此，我們采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作為預(yù)實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下能否將吉西他濱粒子安全地植入豬的胰腺組織中，并觀察粒子局部胰腺組織消融和細(xì)胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象：4只健康家豬，體質(zhì)量40～50kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：4只健康家豬，予速眠新Ⅱ肌內(nèi)注射麻醉。在整個(gè)過(guò)程中，監(jiān)控循環(huán)和呼吸參數(shù)。一臺(tái)帶有3.8mm通道的線陣超聲內(nèi)鏡插入豬的食道中，并進(jìn)入胃腔。在豬的胰腺上確定一個(gè)沒有主胰管或大的動(dòng)靜脈的區(qū)域當(dāng)作假定的腫瘤部位進(jìn)行組織間化療。在內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下經(jīng)過(guò)19G穿刺針通過(guò)最接近胰腺的胃壁插入進(jìn)胰腺，之后將探針取出，將化療粒子放入細(xì)針中，用探針推動(dòng)細(xì)針內(nèi)的化療粒子，將吉西他濱定點(diǎn)植入胰腺。

實(shí)驗(yàn)選擇的化療粒子為合肥工業(yè)大學(xué)控釋藥物研究室所提供的，微球粒徑均＜100μm，含藥微球的含藥量為20%，藥物緩釋時(shí)間為30d。治療后，觀察動(dòng)物14d，注意有無(wú)急性胰腺炎的臨床表現(xiàn)（如食欲不振、易怒等）。治療前抽血查血常規(guī)檢測(cè)，白蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清淀粉酶作為基準(zhǔn)水平，治療后立即抽血驗(yàn)以上數(shù)值，并在組織間化療14d后再次抽血驗(yàn)以上數(shù)值。在化療粒子植入14d后，將豬處死后，剖腹檢查以排除腹腔出血、胰瘺、腹膜炎等并發(fā)癥。取出胰腺組織，化療區(qū)域的變化是可見的。距植入點(diǎn)每間隔10mm取材一次，共5次，對(duì)組織標(biāo)本冰凍保存。對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察組織損傷的程度，計(jì)算變性壞死區(qū)的面積。應(yīng)用免疫組化技術(shù)，用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL）試劑盒，對(duì)組織標(biāo)本的凋亡進(jìn)行免疫組化檢測(cè)和量化分析。細(xì)胞凋亡陽(yáng)性的判斷：光鏡下觀察，凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞的胞核為棕黃色或棕褐色均勻或顆粒狀染色。觀察陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和分布，以40×10倍顯微鏡計(jì)數(shù)一個(gè)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，求出平均每個(gè)高倍視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞百分率，計(jì)算凋亡指數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4只豬都能耐受此實(shí)驗(yàn)。在14d的化療觀察期，豬并沒有表現(xiàn)出的任何臨床癥狀及體征：腹膜出血、感染、急性胰腺炎（沒有食欲或意識(shí)，或者情緒的變化）。血液生化參數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD））如下：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（6.56±0.14）×1012/L、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（29.4±0.21）× 109/L、血小板計(jì)數(shù)（385.25±73.88）×109/L、白蛋白（24.68±0.41）g/L，ALT（59.25±4.5）U/L，ⅡAST（47.5±3.7）U/L，緇血清淀粉酶（758.5±18.3）U/L。手術(shù)后立即檢查酶的水平?jīng)]有變化。在第14天，實(shí)驗(yàn)室調(diào)查結(jié)果：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（6.49±0.50）×1012/L、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（30.05±0.39）×109/L、血小板計(jì)數(shù)（391±113.44）×109/L、白蛋白（25.65±0.80）g/L，ALT（64.75 ±3.20）U/L，ⅡAST（50.5 ±3.11）U/L，緇血清淀粉酶（778.75±17.52）U/L，生化指標(biāo)的變化不顯著（P＞0.05）。將豬安樂死后取出胰腺組織，化療粒子周圍的胰腺組織呈白色（圖1），化療粒子無(wú)移位，所有粒子均可找到。病理組織學(xué)檢查證實(shí)在化療粒子周圍出現(xiàn)纖維素性壞死（圖2）。在壞死組織與非壞死組織之間界線清晰。壞死區(qū)域的平均直徑5.8mm（5.4～6.3mm）。在壞死區(qū)域周圍僅有輕微炎癥出現(xiàn)。放置化療粒子周圍20mm以外的胰腺組織以及周圍器官是正常的。在病灶中心1cm范圍的組織內(nèi)出現(xiàn)了數(shù)量眾多的凋亡細(xì)胞（圖3），凋亡指數(shù)的平均標(biāo)準(zhǔn)差是（47.55±6.7）%。在距病灶中心5 c m 處，幾乎找不到凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)的平均標(biāo)準(zhǔn)差是（0.2295±0.071）%。這2處凋亡指數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 植入化療粒子周圍的胰腺組織變白

圖2 在治療中心處剖開做病理，在化療粒子周圍可見纖維素性壞死

圖3 在化療中心1 cm范圍的組織內(nèi)見大量凋亡細(xì)胞

3 討 論

我們用微創(chuàng)的方法植入化療粒子，采用組織間化療的方法，使化療藥物在局部形成高濃度，達(dá)到器官靶向治療的目的，在延長(zhǎng)化療藥物作用時(shí)間的同時(shí)，不增加化療藥物的全身毒性[3]，望部分或完全取代全身化療，可提高晚期胰腺癌生存期和控制腫瘤相關(guān)癥狀。目前吉西他濱已成為國(guó)內(nèi)外治療胰腺癌一線化療藥物，吉西他濱對(duì)局部進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌具有一定療效[4-5]。間質(zhì)化療能夠提高腫瘤局部的藥物濃度，從而提高腫瘤化療效果，而且毒副作用較小，尤其是可明顯降低吉西他濱的血液學(xué)毒性，同時(shí)藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)中，未見顯著的、立即的或后續(xù)出現(xiàn)的出血、感染、急性胰腺炎或胰管瘺等。無(wú)顯著的生物化學(xué)參數(shù)改變。結(jié)果證明與全身化療相比，組織間化療全身毒性較小。超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的組織間化療無(wú)有害輻射，即該治療對(duì)患者和操作者都是無(wú)害的。病理學(xué)檢查結(jié)果證明在化療粒子周圍出現(xiàn)纖維素樣壞死，在壞死組織與非壞死組織之間界線清晰。細(xì)胞凋亡指數(shù)在化療粒子植入的中心位置1 cm范圍內(nèi)顯著增加。組織間化療誘導(dǎo)了胰腺組織的纖維素樣壞死和細(xì)胞凋亡。所有的豬多能耐受此試驗(yàn)，生化水平?jīng)]有明顯變化。表明超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的豬的胰腺化療粒子植入技術(shù)是可行的，這項(xiàng)技術(shù)有很好的耐受性。

超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的組織間化療將被應(yīng)用于緩解不能手術(shù)切除的胰腺惡性腫瘤。目前的研究還很有限，有必要對(duì)組織間化療的安全性及治療效果進(jìn)行進(jìn)一步的研究。針對(duì)胰腺癌的間質(zhì)化療，一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究都取得了很好的結(jié)果，提示間質(zhì)化療在臨床上的有效應(yīng)用，會(huì)成為改善晚期胰腺癌預(yù)后的有力手段。但是間質(zhì)化療在胰腺癌的臨床應(yīng)用研究中還處于起步階段，有許多問題需要解決。盡管把間質(zhì)化療有效地應(yīng)用于胰腺癌的臨床治療面臨許多難題，但是相信隨著研究的不斷深入，間質(zhì)化療必將成為胰腺癌治療的手段之一。

4 結(jié) 論

組織間化療是通過(guò)手術(shù)、穿刺等方式把化療藥物和載體所形成的復(fù)合物植入腫瘤內(nèi)部，利用載體在體內(nèi)的緩慢降解而達(dá)到對(duì)化療藥物的緩釋作用，使化療藥物在局部形成高濃度，達(dá)到器官靶向治療的目的。超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)的穿刺術(shù)是目前治療胰腺疾病最精確、微創(chuàng)的方法。近年來(lái)，已有關(guān)于各種超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下治療胰腺疾病方法的報(bào)道發(fā)表，包括超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的基因治療、射頻消融、光動(dòng)力學(xué)治療、免疫學(xué)治療、胰腺內(nèi)酒精注入療法、組織間近距治療。這些技術(shù)為化療粒子的植入提供了精確且安全的途徑，為胰腺腫瘤的組織間化療提供了一種新方法。超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下植入吉西他濱用于胰腺的組織間化療不僅安全、耐受性好，而且可使組織消融、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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Endoscopic Ultrasound-guided Implantation of Sustained Release Gemcitabine Chemotherapy for Pancreatic Tissue Between Animal Studies

LI Yu-fei, SUN Si-yu, GE Nan, WANG Shu-peng

(Department of Gastroenterology, Red Cross Hospital of Shenyang, Shenyang 110013, China )

ObjectiveTo investigate the feasibility and safety of endoscopic ultrasonography(EUS)guided interstitial chemotherapy for the pancreas in pig’s mode1.MethodsA therapeutic 19-gauge needle was inserted into the pancreas with EUS guidance, and seeds with sustained release of gemcitabine were implanted into the tissue. After 14 days of clinical observation, the animals were sacrificed and the tissue response to local chemotherapy was examined.ResultsAll the seeds were implanted successfully and no migration was observed. Chemotherapy induced tissue fibrous necrosis was localized in the pancreas without significant complications.The apoptotic index of tissue within 1 am of the seeds increased.ConclusionImplanted gemcitabine into the pancreatic tissue with the guiding of ultrasound endoscopy is not only safety, but also tolerability, it can make the tissue ablate, induce the cell apoptosis.

Pancreas; Endoscopic ultrasonography; Chemotherapy; Gemcitabine

R445.1

B

1671-8194（2013）16-0069-03