大鯢尾部魚(yú)油的酶法提取工藝

張佳嬋, 薛 玲, 王昌濤

(北京工商大學(xué)植物資源研究開(kāi)發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

大鯢俗稱(chēng)“娃娃魚(yú)”,是我國(guó)珍稀名貴特產(chǎn),屬?lài)?guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物,分布于貴州、四川、湖北、湖南、陜西、河南等17個(gè)省區(qū)[1].大鯢棲息在山區(qū)溪流中,所需水質(zhì)清澈、含沙量小、水流湍急,自然繁殖率低,生長(zhǎng)緩慢,人工養(yǎng)殖大鯢成本較高[2].傳統(tǒng)中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論都認(rèn)為大鯢有很高的藥用價(jià)值,長(zhǎng)期食用大鯢肉可以聰明益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能[3].因此,對(duì)大鯢的開(kāi)發(fā)利用和深加工極為重要.目前對(duì)大鯢的研究主要集中在對(duì)其資源狀況[4]、生物學(xué)習(xí)性[5-6]、繁殖[7]、病害[8]以及功能基因[2,9-10]方面,有關(guān)大鯢營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用價(jià)值的研究也有部分報(bào)道[11-15].楊代勤[16]和權(quán)清轉(zhuǎn)等[17]詳細(xì)介紹了大鯢肉氨基酸組成,劉紹等[15]研究了大鯢軟骨與肌肉中幾種重要礦物質(zhì)的含量.楊紅生等[18]研究分析了大鯢組織中的游離脂肪酸,并分析得到了8種常見(jiàn)脂肪酸的含量.大鯢脂肪富含多種不飽和脂肪酸,無(wú)膽固醇,而且大量文獻(xiàn)報(bào)道大鯢脂肪具有預(yù)防心血管疾病的作用,因此利用大鯢脂肪進(jìn)行深加工生產(chǎn)大鯢油具有重要科學(xué)價(jià)值[19-23].并且大鯢脂肪多分布在尾部及腹腔內(nèi),分離簡(jiǎn)單,更為大鯢油的生產(chǎn)提供有利條件.

傳統(tǒng)動(dòng)物油的提取方法有蒸煮法、淡堿水解法、壓榨法,由于提取過(guò)程中的操作條件常常會(huì)破壞這些功能成分,從而影響?hù)~(yú)油的質(zhì)量.酶解法是利用蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解,破壞蛋白質(zhì)和脂肪的結(jié)合,從而釋放出油脂.由于酶解法提取動(dòng)物油脂的工藝條件溫和,提取效率高,且蛋白酶水解產(chǎn)生的酶解液能被充分利用,是提取動(dòng)物油脂的較好方法.目前在動(dòng)物油脂提取方面,應(yīng)用最多的是魚(yú)油.洪鵬志等[24]利用蛋白酶酶解法從黃鰭金槍魚(yú)魚(yú)頭中提取魚(yú)油,并通過(guò)正交試驗(yàn)獲得了最佳的提取工藝參數(shù).本研究利用蛋白酶酶解提取大鯢油,具有污染小、操作條件溫和、提油率高的特點(diǎn).為大鯢尾部脂肪組織的開(kāi)發(fā)利用找出了可靠的途徑并避免了傳統(tǒng)提取方法二次污染的問(wèn)題.

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大鯢尾部組織由浙江永強(qiáng)養(yǎng)殖公司提供;alcalase堿性蛋白酶購(gòu)于Novozymes(北京)酶制劑公司,經(jīng)測(cè)定堿性蛋白酶酶活為7.38×104U/mL;其他試劑均為分析純,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

ZN-048型小型粉碎機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);TB-214型電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;PHS-3C型 pH計(jì),上海雷磁儀器廠(chǎng);UV mini-1240型紫外分光光度計(jì),日本島津;SCR20BC型高速冷凍離心機(jī),日本立牌;HQ45型恒溫?fù)u床,中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠(chǎng);6890N型氣相色譜儀,美國(guó)Agilent公司;5975C inert XL MSD型質(zhì)譜儀,美國(guó)Agilent公司.

1.2 方法

1.2.1 大鯢油的提取工藝

大鯢尾部組織→清洗→絞碎→按物料質(zhì)量比1∶10加水勻漿→pH值為6.0,50℃alcalase堿性蛋白酶酶解1 h→沸水浴滅酶15 min→5 000 r/min離心20 min→分離→提取稱(chēng)重→計(jì)算提油率.

1.2.2 提油率的計(jì)算

1.2.3 堿性蛋白酶提取粗大鯢油的單因素實(shí)驗(yàn)

以提油率為指標(biāo),分別考察pH值、溫度、加酶量(占勻漿前大鯢組織質(zhì)量的百分比)、酶解時(shí)間對(duì)提取大鯢油工藝的影響,每個(gè)因素設(shè)定5個(gè)梯度,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次.

1.2.4 堿性蛋白酶提取粗大鯢油的正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較大的pH、溫度、加酶量和酶解時(shí)間4個(gè)因素為考察對(duì)象進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以提油率為指標(biāo),確定大鯢油的最佳酶解工藝.

1.2.5 粗大鯢油理化指標(biāo)的測(cè)定

水分及揮發(fā)物的測(cè)定按GB/T 5528—2008規(guī)定執(zhí)行.其中空氣烘箱法的烘干溫度為100±2℃,烘干時(shí)間為30 min,復(fù)烘時(shí)間為15 min.酸價(jià)的測(cè)定按GB/T 5530—2005規(guī)定執(zhí)行.過(guò)氧化值的測(cè)定按GB/T 5538—2005規(guī)定執(zhí)行.不皂化物的測(cè)定按GB/T 5535.1—2008、GB/T 5535.2—2008 規(guī)定執(zhí)行.碘價(jià)的測(cè)定按GB/T 5532—2008規(guī)定執(zhí)行.雜質(zhì)的測(cè)定按GB/T 15688—2008規(guī)定執(zhí)行.

1.2.6 大鯢油脂肪酸組成分析

取油試樣0.6 mL于離心試管中,加入5 mL正己烷,搖勻,再加入0.25 mL 2 mol/L氫氧化鉀的甲醇溶液,充分振搖30 s,放入離心機(jī)內(nèi)離心1 min后,取上層液體,進(jìn)行GC-FID-MS色譜脂肪酸成分含量測(cè)定.

GC-FID-MS分析條件為采用DB-WAX毛細(xì)柱(30 m ×250 μm ×0.25 μm),進(jìn)樣量 1 μL,FID 檢測(cè)器氫氣流量40.0 mL/min,空氣流量450 mL/min.尾氣吹掃是He氣,45 mL/min.程序升溫范圍是80～290℃,升溫速率4℃/min,290℃保持30 min.采用質(zhì)譜儀,溶劑延遲1 min,掃描質(zhì)量數(shù)范圍m/z 50～550u,前進(jìn)樣口250℃,色譜柱流量1.2 mL/min,MS四極桿150℃,離子源230℃.利用面積歸一化法將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶制備粗大鯢油的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度的影響

溫度對(duì)酶的催化活性及效率有重要的影響.一般高溫有利于提高酶促反應(yīng)速率,但卻能夠降低酶的穩(wěn)定性,進(jìn)而酶活力降低.本實(shí)驗(yàn)保持pH值為7,酶添加量1%,酶解1 h不變,分別考察30,40,45,50,55,60,65℃溫度下alcalase堿性蛋白酶對(duì)大鯢油提取率的影響,如圖1.圖1表明,酶解溫度控制在45～55℃附近大鯢油的提油率較高,可達(dá)到60%以上.

2.1.2 pH 值的影響

在溫度為55℃,水解時(shí)間為1 h,酶添加量為1%的條件下,考察了pH值范圍為5～10時(shí)對(duì)提油率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2.從圖2可以看出,pH值在6～9均保持較高的提油率,pH值高于9時(shí),提油率有明顯下降.可能是由蛋白酶最適pH值所致.但由于堿性環(huán)境可能會(huì)促使所得大鯢油的進(jìn)一步水解,不利于大鯢油質(zhì)量的保持,故選擇pH值為6作為后續(xù)試驗(yàn)條件.

圖2 pH值對(duì)提油率的影響Fig.2 Effects of pH on yield of oil

2.1.3 加酶量對(duì)提油率的影響

保持酶解溫度55℃,水解時(shí)間1 h和pH值為7,觀(guān)察酶添加量對(duì)提油率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可知,隨著酶添加量的增加,大鯢油的提取率越高.但是,提油率并非隨著酶添加量增加而一直保持增長(zhǎng)趨勢(shì).當(dāng)酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.5%時(shí),提油率不再隨著酶添加量的增大而增大(p＞0.05),這可能是由于底物已全部與酶形成酶-底物復(fù)合物,沒(méi)有多余的底物與酶接觸.因此,從反應(yīng)程度及經(jīng)濟(jì)方面考慮,酶的最適添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%.

圖3 加酶量對(duì)提油率的影響Fig.3 Effects of enzyme amounts on yield of oil

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響

在酶解溫度為55℃,酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%,pH值為6的條件下,在酶解時(shí)間分別為10 min,20 min,0.5 h,1 h,1.5 h,2 h,2.5 h時(shí)進(jìn)行酶解,結(jié)果見(jiàn)圖4.酶解時(shí)間低于0.5 h(30 min)時(shí),提油率誤差較大,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),提油率也隨之增加,主要是酶解時(shí)間的增加使得酶與底物的相互作用比較充分,能夠充分破壞脂肪和蛋白質(zhì)的關(guān)系,釋放出脂肪分子.隨著時(shí)間的進(jìn)一步增加,大鯢油的提取率并沒(méi)有進(jìn)一步增加,反而顏色有變深趨勢(shì),可能是由于大鯢油中不飽和脂肪酸發(fā)生氧化,不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保持,因此酶解時(shí)間為1 h最為合適.

圖4 酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響Fig.4 Effects of reaction time on yield of oil

2.2 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取pH值、加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間4因素,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化大鯢油提取條件,其結(jié)果見(jiàn)表1.極差R分析發(fā)現(xiàn)R(C)＞R(B)＞R(D)＞R(A),因此4種因素對(duì)大鯢油提取率影響主次順序?yàn)闇囟龋炯用噶浚痉磻?yīng)時(shí)間＞pH.對(duì)于pH值,K2＞K3＞K1,因此選擇水平2為較優(yōu)水平.同理可得加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的較優(yōu)水平.因此較優(yōu)水平條件為A2B3C2D2,即pH值為6,加酶量1.5%,時(shí)間為1 h,溫度為50℃.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析Tab.1 Orthogonal experimental design and analysis

2.3 優(yōu)化反應(yīng)條件的結(jié)果驗(yàn)證

將以上優(yōu)化的反應(yīng)條件(pH=6,加酶量1.5%,時(shí)間為1 h,溫度為50℃),進(jìn)行3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證,3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異,提油率為(63.9±1.0)%,表明試驗(yàn)優(yōu)化的工藝條件是可行的.

2.4 理化指標(biāo)的測(cè)定

所得粗大鯢油的各種理化指標(biāo)與水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3502—2000所規(guī)定的不同等級(jí)粗魚(yú)油指標(biāo)的對(duì)照見(jiàn)表2.實(shí)驗(yàn)所得粗大鯢油符合我國(guó)規(guī)定的二級(jí)粗魚(yú)油標(biāo)準(zhǔn).

表2 粗魚(yú)油的理化指標(biāo)Tab.2 Physicochemical indexes of raw fish oil

2.5 粗大鯢油脂肪酸組成分析

按照GC-MS條件將甲酯化粗大鯢油樣品進(jìn)行測(cè)定,采用計(jì)算機(jī)檢索和人工解析各峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖,用面積歸一化法分析計(jì)算相對(duì)含量,結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 脂肪酸組成分析Tab.3 Fatty acids compositions and contents

粗大鯢油甲酯化后,共檢測(cè)到16種脂肪酸甲酯,其中,飽和脂肪酸占24.1%,棕櫚酸最高為16.1%;不飽和脂肪酸占 62.5%,其中油酸占25.2%.單不飽和脂肪酸占40.1%,其中主要為油酸(25.2%),多不飽和脂肪酸為22.4%,主要為棕櫚一烯酸(9.4%),其次為亞麻酸(7.0%);其中DHA、EPA分別為4.2%,4.7%.此外,還有一些非脂肪酸類(lèi)物質(zhì),占13.4%.

3 結(jié) 論

以大鯢尾部脂肪組織為原料,采用堿性蛋白酶酶解工藝,利用正交試驗(yàn)法得到了大鯢油提取的最佳工藝,其堿性蛋白酶水解條件為溫度為50℃,時(shí)間為1 h,加酶量1.5%,pH值為6,在該工藝條件下理論提油率為64.9%.通過(guò)3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證,3組試驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異,平均提油率為63.9%,表明優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件可行.經(jīng)過(guò)理化指標(biāo)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)所得粗大鯢油符合國(guó)家二級(jí)粗魚(yú)油標(biāo)準(zhǔn).對(duì)所得粗大鯢油進(jìn)行脂肪酸組成和含量的測(cè)定,大鯢油中共檢測(cè)到16種脂肪酸,飽和脂肪酸占37.5%,不飽和脂肪酸為62.5%,其中DHA為4.7%,EPA為4.2%.

參考文獻(xiàn):

[1] 李林強(qiáng),昝林森,田萬(wàn)強(qiáng),等.大鯢脂肪組織分布及其理化特性[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(2):7--10.

[2] Zhang Peng,Chen Yueqin,Liu Yifei,et al.The complete mitochondrial genome of the Chinese giant salamander,Andrias davidianus(Amphibia:Caudata)[J].Gene,2003,311(5):93--98.

[3] 張神虎.大鯢的藥用價(jià)值及人工養(yǎng)殖[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2001,20(4):309-310.

[4] 宋鳴濤.秦嶺太白山北坡兩棲爬行動(dòng)物[J].動(dòng)物學(xué)雜志,1986(5):9--12.

[5] Chan S T H,Sandor T,Lofts B.A histological,histochemical,and biochemical study of the adrenal tissue of the Chinese giant salamander(Andrias davidianus Blanchard)[J].General and Comparative Endocrinology,1975,25(4):509-516.

[6] Lan Shucheng,Li Dongfeng,Jiang Jinchang,et al.Call and skin glands secretion induced by stimulation of midbrain in urodele(Andrias davidianus)[J].Brain Research,1990,528(1):159-161.

[7] 楊楚彬,羅凱坤,周海燕,等.大鯢輸卵管的基本組織結(jié)構(gòu)及其發(fā)育變化[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2003,26(1):64--68.

[8] 王高學(xué),白占濤.大鯢赤皮病病原分離鑒定及防治試驗(yàn)[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,27(4):71-74.

[9] Rafael Z,Edward M,Michael V,et al.Complete nucleotide sequence of the mitochondrial genome of a salamander,Mertensiella luschani[J].Gene,2003,317(23):17-27.

[10] Yang Liping,Meng Zining,Liu Yun,et al.Growth hormone and prolactin in Andrias davidianus:cDNA cloning,tissue distribution and phylogenetic analysis[J].General and Comparative Endocrinology,2010,165(2):177-180.

[11] 王軍,于月英,李林強(qiáng),等.中國(guó)大鯢油脂肪酸成分及流變性分析[J].食品科學(xué),2009,30(24):405-408.

[12] 李林強(qiáng),昝林森.中國(guó)大鯢肌內(nèi)脂肪酸組成及其抗氧化研究[J].食品工業(yè)科技,2010(1):364-366.

[13] 黃世英,郭文韜,楊志偉,等.人工養(yǎng)殖大鯢肉營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(5):1--2.

[14] 劉紹,孫麟,陽(yáng)愛(ài)生,等.飼養(yǎng)中國(guó)大鯢氨基酸組成分析[J].氨基酸和生物資源,2007,29(4):53-55.

[15] 劉紹,陽(yáng)愛(ài)生,彭國(guó)平,等.飼養(yǎng)中國(guó)大鯢軟骨與肌肉中幾種重要礦物質(zhì)的ICP-AES法測(cè)定與分析[J].食品工業(yè)科技,2007,28(8):225-226.

[16] 楊代勤.大鯢可食部分水解,游離氨基酸的初步研究[J].水生生物學(xué)報(bào),1990,14(3):286--288.

[17] 權(quán)清轉(zhuǎn),郭亮俠,蔣志武.大鯢肉氨基酸成分分析[J].淡水漁業(yè),1987(4):39-40.

[18] 楊紅生,楊干榮,王輝.大鯢六種組織中游離脂肪酸的分析[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1992,20(1):115-117.

[19] 羅慶華.中國(guó)大鯢營(yíng)養(yǎng)成分研究進(jìn)展及食品開(kāi)發(fā)探討[J].食品科學(xué),2010,31(19):390-393.

[20] 王文莉,張偉,于新瑩,等.大鯢肉酶解產(chǎn)物的制備及其抗氧化性的研究[J].河北漁業(yè),2012,9:1-4.

[21] 李偉,于新瑩,佟長(zhǎng)青.大鯢黏液酶解產(chǎn)物的制備及其抗疲勞作用研究[J].食品工業(yè)科技,2011(6):146-148.

[22] 張神虎.大鯢的藥用價(jià)值及人工養(yǎng)殖[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物,2003,6(2):16-17.

[23] 陳德經(jīng),陳曦,方斌,等.大鯢不同部位的抑菌效果研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(23):14109-14110.

[24] 洪鵬志,劉書(shū)成,章超樺,等.金槍魚(yú)油的精煉及其脂肪酸組成特征[J].中國(guó)油脂,2006,31(6):90-93.