熟制鮑魚殘留細(xì)菌的分離及16S r DNA鑒定

鄭瑞生, 陳涼涼, 肖 熙

(1.泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,福建泉州 362002;2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

鮑魚營(yíng)養(yǎng)豐富,味道鮮美,具有潤(rùn)肺、滋腎補(bǔ)虛等功效,深受廣大消費(fèi)者喜愛.但是對(duì)于鮮鮑的烹飪并非人人都會(huì),而將其加工成方便、快捷、安全的即食鮑魚既可以豐富鮑魚的產(chǎn)品品種,又可以滿足現(xiàn)代都市人的需求.但由于鮑魚加工過程受熱不均,殺菌不夠徹底,容易導(dǎo)致烘制后的鮑魚發(fā)生黑變、流汁、惡臭等現(xiàn)象,造成產(chǎn)品的腐敗變質(zhì),縮短產(chǎn)品的保質(zhì)期.有研究認(rèn)為大多數(shù)情況下食品中只有部分微生物參與腐敗過程[1].針對(duì)這種情況,在20世紀(jì)90年代中期Dalgaard明確提出了特定腐敗菌(specific spoilage organism,SSO)的概念[2-3].在剛加工完產(chǎn)品的微生物菌群中特定腐敗菌數(shù)量少,但這些特定腐敗菌在貯藏過程中生長(zhǎng)較其他微生物快,并且腐敗活性增強(qiáng)[4].因此,研究熟制鮑魚產(chǎn)品中殘留的特定腐敗菌,對(duì)于有針對(duì)性的采取控制措施,防止其發(fā)生腐敗變質(zhì),保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有十分重要的意義.食品中微生物的分離鑒定通常依賴于各種各樣的表型觀察.但由于有些表型不典型可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果[5].目前出現(xiàn)了許多基于分子生物學(xué)技術(shù)的快速而直接的檢測(cè)微生物的方法,其中細(xì)菌的序列分析是目前較好的新方法之一,16SrDNA分子大小適中,有足夠的遺傳信息用于分類研究,因此在許多細(xì)菌分離鑒定上被廣泛使用[6-7].

本文采用平板劃線分離方法,對(duì)烘制后的鮑魚中殘留的主要細(xì)菌菌群進(jìn)行分離,并通過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色分析和16S rDNA序列比對(duì)的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定.從而為烘制鮑魚加工過程中殘留腐敗菌的控制,延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

鮑魚購于福州市水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng),重量在50 g左右的鮮活鮑魚,加冰條件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室.將鮮活鮑魚進(jìn)行開殼、取肉,洗凈后選擇鮑體飽滿、大小一致、外膜透明、有鮑魚固有氣味的鮑魚,瀝水,放入超低溫冰箱中進(jìn)行單體快速凍結(jié).選取凍結(jié)后鮑魚進(jìn)行解凍、清洗、瀝干,用鋁盤盛后放入100℃烘箱中進(jìn)行烘制5 min,冷卻裝入無菌三角瓶中,并于24 h內(nèi)分析該加工后的鮑魚殘留菌情況.

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、葡萄糖、氯化鈉、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂,均購于國(guó)藥集團(tuán);酵母提取物,上海生物工程有限公司;革蘭氏染色試劑盒,購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;d NTPs(4種脫氧核苷三磷酸)、10倍濃度的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)緩沖液(Mg2+Plus)、Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker均購于TaKaRa生物工程有限公司;Universal DNA Purification Kit,天根生化(北京)科技有限公司;Agarose 1-H,BBI生物科技有限公司;Agar A,波士頓生物技術(shù)(BBI)有限公司.溶菌酶(Lysozyme)(酶活＞22 800 U/mg)和蛋白酶K(Proteinase K)(酶活為30 U/mg)均購于BBI生物科技有限公司.

100 mmol/L Tris-HCl母液是取三羥甲基氨基甲烷(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane,Tris)12.1 g,溶于去離子水中,再用100 mmol/L鹽酸調(diào)整pH值至8.0,定容至1 L,高壓121℃滅菌30 min后備用.

100 mmol/L EDTA母液是取乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)29.2 g,溶于去離子水中,再用100 mmol/L氫氧化鈉調(diào)整pH值至8.0,定容至1 L,高壓121℃滅菌30 min后備用.

TE溶液是取100 mL Tris-HCl母液和10 mL EDTA母液用去離子水定容至1 L,高壓121℃滅菌30 min后備用.

DNA提取緩沖液由100 mmol/L Tris-HCl母液(pH值8.0),100 mmol/L EDTA母液(pH值8.0),100 mmol/L磷酸鈉,1.5 mol/L NaCl,質(zhì)量濃度為1%的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HTAB)組成,高壓121℃滅菌30 min后備用.

1.2.2 主要儀器設(shè)備

AL-204型電子天平,特勒-托利多儀器(上海)有限公司;電熱干燥箱,上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠;CT-2000型高壓滅菌鍋,天津市超拓科貿(mào)有限公司;SW-CJ-1FB型超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)安泰公司;GSP-9160MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱,海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HZQ-F型全溫振蕩培養(yǎng)箱,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;電動(dòng)勻漿機(jī),國(guó)華科技有限公司;Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡;AG22331型 PCR擴(kuò)增儀,德國(guó) Eppendorf Hamburg公司;Tanon2500R型凝膠成像系統(tǒng),Tanon科技上海有限公司;紫外反射透射儀,上海精科實(shí)業(yè)有限公司;SDC-6型恒溫水浴鍋,波新芝生物科技股份有限公司;D-YY-12型電腦三恒多用電泳儀,北京六一儀器廠;Lx-100型手掌型離心機(jī),江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;UB-7型酸度計(jì),ENVER INSTRUMENT公司;微量移液器(10,100,200,1 000μL),德國(guó)Eppendorf Hamburg公司;GL-20G-H型冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;H1650-W型臺(tái)式高速離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;ND-1000型核酸測(cè)定儀,美國(guó)Nano Drop公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 主要?dú)埩艟姆蛛x純化與初步鑒定

取熟制后的鮑魚10 g,放入滅菌后的生理鹽水100 mL中,于20℃條件下進(jìn)行振蕩搖勻,至肉湯明顯混濁,取1 mL肉湯,用10倍遞增法進(jìn)一步制成1×10-2,1×10-3,1×10-4和1×10-5等體積分?jǐn)?shù)的稀釋液,取 100μL稀釋體積分?jǐn)?shù)為 1×10-3,1×10-4和1×10-5的稀釋液涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(含0.5%葡萄糖)進(jìn)行培養(yǎng),挑取菌落數(shù)在30～300個(gè)左右的平板,對(duì)典型的單菌落反復(fù)進(jìn)行劃線分離、純化.共篩選出52株,將分離純化后的單菌落放置于35℃培養(yǎng)箱中(該溫度條件下有利于嗜中溫性海洋細(xì)菌生長(zhǎng),同時(shí)可防止溫度過高導(dǎo)致培養(yǎng)基水分散失較多,邊緣發(fā)生干裂),培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落觀察,包括菌落的大小、形態(tài)、顏色、隆起度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)、光澤度、透明度及質(zhì)地等.同時(shí)挑取長(zhǎng)勢(shì)好的單一菌落,對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色及芽孢染色,并在顯微鏡下觀察.

2.2 鮑魚殘留細(xì)菌的總DNA提取及PCR擴(kuò)增

2.2.1 鮑魚殘留細(xì)菌總DNA的提取

挑取經(jīng)分離純化后的菌樣數(shù)環(huán),置于20 mL滅菌后的營(yíng)養(yǎng)肉湯中(含0.5%葡萄糖),于35℃條件下進(jìn)行振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)24 h,至菌液明顯混濁(說明微生物大量生長(zhǎng)).取上述菌液1 mL,12 000 r/min室溫離心5 min,棄上清得菌體沉淀,再加入1 mL TE溶液,充分震蕩使菌體懸浮,加入200μL溶菌酶(10 mg/L)37℃水浴30 min,再加入3 mL DNA提取緩沖液和20μL蛋白酶K(20 mg/mL),混勻后于65℃下水浴1 h,期間每20 min中放入-80℃超低溫冰箱凍融10 min,重復(fù)3次.

凍融完畢后,加入等體積的Tris飽和酚-氯仿-異戊醇混合溶液(V(Tris飽和酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1),輕輕混勻,常溫 12 000 r/min 離心10 min,小心吸取上層溶液于另一離心管中,溶液再用等體積的氯仿-異戊醇混合溶液(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)抽提一次,之后加入0.6倍體積的預(yù)冷的異丙醇,4℃靜置沉淀1 h后,4℃ 12 000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀用1 mL 70%的乙醇(含0.1 mol/L,醋酸鈉)重復(fù)洗滌2～3次,沉淀于超凈臺(tái)下吹干,以去除殘留的乙醇.最后沉淀溶解于50μL的TE中.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA完整性,并進(jìn)行DNA濃度的測(cè)定.

2.2.2 PCR擴(kuò)增

以2.2.1提取的 DNA作為模板,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增.

1) 反應(yīng)引物：引物 1(27F)：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′;引物 2(1492R)：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.

2)反應(yīng)體系(50μL)：25μL的反應(yīng)體系中含有10倍PCR緩沖液(Mg2+Plus)2.5μL、dNTP(2.5 mmol/L)2.0μL、適度稀釋的模板DNA(約10 ng)1 μL、Taq酶(2.5 U/μL)0.4 μL、引物 1 和引物 2 各0.5μL(10 pmol/L)、重蒸水18.1μL.

3)反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10 min.

2.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收純化,由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序.將拼接后的測(cè)序結(jié)果輸入 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast,利用BLAST軟件,將測(cè)定得到的基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)分析,進(jìn)行同源相似性比較.

3 結(jié)果與討論

3.1 殘留細(xì)菌分離及染色結(jié)果

從熟制鮑魚中挑取具有典型菌落形態(tài)特征的殘留菌52株.根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色,及芽孢染色結(jié)果對(duì)其進(jìn)行初步分類,其中典型的主要?dú)埩艏?xì)菌有7株,其編號(hào)及菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果、形態(tài)特征描述分別見圖1、圖2及表1.

3.2 16S r DNA基因同源性分析結(jié)果

3.2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

分別提取7株菌的基因組DNA后,利用PCR擴(kuò)增其16SrDNA基因片段,取PCR產(chǎn)物5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,如圖3.各樣品都在1 500 bp處出現(xiàn)明顯條帶,說明供試菌株的16S rDNA基因擴(kuò)增成功.

3.2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序及菌株鑒定

測(cè)定殘留細(xì)菌的16S rDNA全序列,分析其同源性,明確各種菌的種屬類別.將獲得的有效序列提交到NCBI,通過Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)(http：∥ncbi.nlm.nih.gov/blast).PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,進(jìn)行核苷酸序列分析,結(jié)果見表2.

圖1 主要?dú)埩艟桨寰涮卣鱂ig.1 Characteristics of main residual bacteria colonies

圖2 主要?dú)埩艟锾m氏染色Fig.2 Gram staining of main residual bacteria

表1 主要?dú)埩艟男螒B(tài)特征Tab.1 Morphological characteristics of main residual bacteria

表2 主要?dú)埩艟蔫b定結(jié)果Tab.2 Identification results of main residual bacteria

由表2可知,分離到的細(xì)菌序列與Genbank中最接近細(xì)菌的同源性達(dá)到99%,最終確定這些細(xì)菌分別為：希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)、庫特氏桿菌屬(Kurthia sp.)、海洋類香菌(Myroides pelagicus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、腸桿菌屬(Enterobacter sp.)、彭氏變形桿菌(Proteus penneri)等,各自在殘留細(xì)菌中所占比例分別為21.15%(11株)、21.15%(11株)、17.31%(9株)、17.31%(9 株)、9.62%(5 株)、9.62%(5株)、3.85%(2株).由此可見,希瓦氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬是烘制鮑魚中主要的殘留細(xì)菌.

圖3 主要?dú)埩艟?6SrDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic graph of 16SrDNA amplified from main residual bacteria

4 結(jié) 論

本研究從烘制鮑魚中分離出的殘留細(xì)菌,經(jīng)過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色以及16S rDNA序列分析后,鑒定其分別為希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)、庫特氏桿菌屬(Kurthia sp.)、海洋類香菌(Myroides pelagicus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、腸桿菌屬(Enterobacter sp.)、彭氏變形桿菌(Proteus penneri)等,其在殘留的細(xì)菌中所占比例分別為21.15%,21.15%,17.31%,17.31%,9.62%,9.62%,3.85%.其中希瓦氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、蠟樣芽孢桿菌、腸桿菌屬及彭氏變形桿菌為常見的腐敗菌,而庫特氏桿菌屬、海洋類香菌較為少見.希瓦氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬又是烘制鮑魚中主要的殘留細(xì)菌.

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