膠體金測試條快速定量測定嘔吐毒素技術(shù)在糧食中的應(yīng)用

李培真, 尚艷娥, 郭 健, 劉美辰

(國家糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,北京 100162)

嘔吐毒素(vomitoxin)又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),是一種單端孢霉烯族毒素,主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生.DON在體內(nèi)可能有一定的蓄積,但無特殊的靶器官,具有很強的細胞毒性,可導(dǎo)致動物腸功能紊亂,口腔黏膜和真皮損傷,免疫力下降[1].農(nóng)作物在生長、收割、儲存等環(huán)節(jié)水分含量偏高,就容易生成真菌毒素[2],根據(jù)王曉云等[3]在2005年調(diào)研發(fā)現(xiàn),嘔吐毒素對農(nóng)作物的污染呈現(xiàn)出高污染率、低污染程度的趨勢.目前比較常用的檢測技術(shù)主要是：薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)[4]及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]等.我國糧食收購時間集中、收購量大、工作條件簡單,而上述檢測方法均為實驗室操作,因此,尋求準確、快速、簡便的檢測方法對毒素進行定性、定量分析,是真菌毒素檢測研究的一個重要課題.

免疫膠體金層析快速診斷試紙條是20世紀90年代以來,在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù),該技術(shù)以其快速、準確且容易被基層掌握并大面積推廣的特點[6],在生物醫(yī)學(xué)各研究領(lǐng)域、微生物檢測、獸醫(yī)快速檢測以及食品安全檢測等方面得到了日益廣泛的應(yīng)用.嘔吐毒素定量快速檢測條是以膠體金層析式免疫競爭為原理,以小分子化合物為檢測對象[7-8],運用側(cè)流技術(shù),發(fā)展起來的一種真菌毒素快速檢測方法.

本課題對膠體金測試條法快速定量測定糧食中嘔吐毒素進行應(yīng)用性研究,評估該法的檢測限、定量限、線性范圍、準確性、重復(fù)性等參數(shù),以驗證此方法在檢測糧食中嘔吐毒素的適用性.

1 材料與方法

1.1 樣品來源

小麥粉7份,玉米5份,大米1份.兩份小麥陰性樣品,剩余11份樣品嘔吐毒素質(zhì)量分數(shù)為520～4 850μg/kg,共計13份樣品分別由國家糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心和美國Charm公司提供的有證參考物質(zhì).

1.2 材料與設(shè)備

嘔吐毒素試劑盒,包括嘔吐毒素定量檢測條,質(zhì)量分數(shù)為1 000μg/kg的嘔吐毒素陽性質(zhì)控,嘔吐毒素定量(deoxynivalenol quantitative,DONQ)稀釋緩沖液,快速一步分析(Rapid one step assay,ROSA)-M孵育器,ROSA-M讀數(shù)儀,以上均由美國Charm公司提供;KD10K型離心機,鹽城凱特實驗儀器設(shè)備有限公司;去離子水.

1.3 樣品處理與檢測方法

1.3.1 樣品處理方法

取樣品研磨成粉末使其通過20目篩,混勻樣品,取50 g樣品加入5倍的去離子水劇烈震蕩1～2 min,靜置1 min以獲得樣品提取物,如靜置效果不佳,可取1.0～1.5 mL提取物至離心管中,離心10 s,獲得上清液即為樣品提取物.移取100μL樣品提取物至分裝的1.0 mL DONQ稀釋緩沖液中,密閉混合和標記,即為稀釋提取物.

1.3.2 樣品檢測方法

逐一標記檢測條后,打開已升溫至45℃并恒溫的ROSA-M孵育器蓋子,將檢測條平底一側(cè)朝上放入ROSA-M孵育器,揭開檢測條粘膜至指示線處,使樣品槽暴露;移取300±15μL的稀釋提取物或質(zhì)控物至樣品槽,壓下粘膜重新密閉樣品槽,所有過程應(yīng)在1 min之內(nèi)完成;蓋上孵育器蓋子,孵育5 min,取出檢測條,2 min之內(nèi)使用ROSA-M讀數(shù)儀讀取結(jié)果.

1.3.3 陽性樣品定值濃度測定方法

所有樣品參考濃度測定方法均按照國家標準規(guī)定方法進行[9].

2 結(jié)果與討論

采用玉米、小麥、大米污染和無污染(陰性)樣品共13份測試,每份樣品按照1.3.1樣品處理和1.3.2檢測方法要求測定6次,每次測定雙平行樣,共計測定156次,記錄測試結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計情況.

2.1 檢測限和定量限測定結(jié)果

通過對兩份無污染(陰性)樣品的測定,共計得出24次陰性檢測數(shù)據(jù),對結(jié)果進行計算分析,檢測限(LOD)為測定平均值加3倍標準偏差,定量限(LOQ)為測定平均值加10倍標準偏差.測試結(jié)果表明,嘔吐毒素的檢測限為118μg/kg,定量限為316μg/kg,完全滿足分析要求.

2.2 線性范圍測定結(jié)果

采用同一種樣品,以高效液相色譜法檢測結(jié)果為橫坐標,膠體金測試條法的檢測結(jié)果為縱坐標,計算線性范圍內(nèi)的相關(guān)性.小麥的線性范圍：500～5 000μg/kg(5點);回歸方程：y=1.04x-119;相關(guān)系數(shù)r為0.999 2,說明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好,線性關(guān)系圖見圖1.

圖1 小麥中嘔吐毒素兩種方法檢測值的線性關(guān)系Fig.1 Linear relationship between two methods for detecting value of vomintoxin in wheat

玉米的線性范圍：800～5 000μg/kg(5點);回歸方程：y=1.16x-5.49;相關(guān)系數(shù)R為0.998 7,說明在該濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好,線性關(guān)系見圖2.

圖2 玉米中嘔吐毒素兩種方法檢測值的線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship between two methods for detecting value of vomintoxin in corn

2.3 準確性測定結(jié)果

2.3.1 與標準方法參考值比較

使用膠體金測試條法與高效液相色譜標準方法分別對13組樣品中的11組陽性樣品進行檢測,采用配對t檢驗法比較兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異,具體見表1.

表1 嘔吐毒素兩種檢測方法配對t-檢驗結(jié)果分析Tab.1 Results analysis of paired t-test of two detection methods for vomintoxin

經(jīng)計算,tD=1.6,查t分布表,t0.05,10=2.23,tD=1.6＜t0.05,10=2.23,說明液相參考值與ROSA測試條法測定值之間無顯著差異,即兩種檢測方法的測定結(jié)果一致.

2.3.2 正確度測定結(jié)果

除去陰性樣品后的陽性樣品,以高效液相色譜法的測定結(jié)果作為認定值,將膠體金測試條法的測定結(jié)果與之比較,按正確度(%)=檢測值/認定值×100計算.11個樣品的正確度在90.3% ～133.9%,平均值為106%,正確度較好,具體見表2.

表2 嘔吐毒素兩種檢測方法正確度結(jié)果分析Tab.2 Results analysis of detecting accuracy of two methods for vomintoxin

2.4 重復(fù)性測定結(jié)果

每個樣品進行6次雙平行檢測,連續(xù)對13個樣品進行同樣的檢測,以此進行重復(fù)性驗證.對除去陰性樣品的11個陽性樣品進行檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計,根據(jù)統(tǒng)計,其變異系數(shù)范圍在4.7% ～19.6%,平均變異系數(shù)為11.8%,整體變異系數(shù)較小,具體數(shù)據(jù)見表3.

表3 嘔吐毒素膠體金測試條法重復(fù)性測定結(jié)果分析Tab.3 Results analysis of repeated measurement of colloidal gold strips method for vomintoxin

3 結(jié) 論

對膠體金測試條快速定量法檢測糧食中嘔吐毒素進行研究,通過簡單的樣品前處理,測試條點樣、孵育器孵育、讀數(shù)儀讀數(shù)這幾個步驟,15 min之內(nèi)就能完成一個樣品的測定,方法要求條件低、操作簡單.將測定值與液相色譜測得的定值比較,通過對檢測限、定量限、線性范圍、準確性、重復(fù)性等參數(shù)的統(tǒng)計分析,均能滿足糧食中嘔吐毒素測定的要求,易于推廣應(yīng)用.

[1] 王文龍,劉陽,李少英,等.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與人類健康[J].食品研究與開發(fā),2008,29(6)：153-157.

[2] 孫秀蘭,邵景東,王俊雙.糧油食品中嘔吐毒素危害及風(fēng)險分析[J].糧食與油脂,2006(3)：41-43.

[3] 王曉云,于雅琴,俞瓊.2005年中國居民膳食DON污染調(diào)查及暴露評估[J].長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,21(2)：101-103.

[4] 俞瓊,計融,王曉云.玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的氣相色譜分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2007(9)：939-941.

[5] 張曉飛,岳延濤,楊美華,等.色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在真菌毒素檢測中的研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(12)：109-114.

[6] 尚艷娥.真菌毒素檢測技術(shù)研究進展[J].北京工商大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2012,30(4)：15-18.

[7] 許艷麗,鮑蕾.免疫膠體金技術(shù)及其在真菌毒素檢測中的應(yīng)用[J].中國釀造,2010(7)：13-17.

[8] 張道宏,李培武,張奇,等.污染糧油食品的主要真菌毒素及膠體金免疫層析技術(shù)在快速檢測中的應(yīng)用[J].中國油料作物學(xué)報,2010(4)：577-582.

[9] 張輝珍,王曉濱,單連菊,等.GB/T 23503—2009 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法[S].北京：中國標準出版社,2009.