鹽酸法舒地爾預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理對(duì)離體大鼠心肌缺血/再灌注的影響

關(guān)月娥 ，賈大林，吳 楠，舒雯琪，陳寶君，王 媛

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

心肌缺血后盡早對(duì)缺血區(qū)進(jìn)行血液再灌注是阻止心肌細(xì)胞死亡的惟一有效方法。然而，再灌注本身會(huì)加重并擴(kuò)大缺血后心肌細(xì)胞損傷，即發(fā)生再灌注損傷。研究［1］表明，缺血后處理，即心肌缺血后在經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間再灌注之前進(jìn)行的反復(fù)、短暫的再灌注/缺血循環(huán)，可明顯減輕心肌再灌注損傷。缺血后處理的心肌保護(hù)作用已經(jīng)在多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物甚至人類身上得到了證實(shí)［2～4］。Rho激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究［5］發(fā)現(xiàn)，Rho激酶參與了多種心臟的病變過程。近來還發(fā)現(xiàn)Rho激酶在缺血心肌中被異常激活，這可能與缺血引起的心肌損傷密切相關(guān)［6］。研究［7］表明，Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)缺血性心臟疾病有治療作用。也有研究［8］證實(shí)，法舒地爾能發(fā)揮類似缺血預(yù)處理樣的心臟保護(hù)作用。2012年10月1日～2013年3月1日，我們采用大鼠離體心臟缺血/再灌注模型，觀察法舒地爾預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理對(duì)離體大鼠心肌缺血/再灌注的影響，初步探討其可能的心肌保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 健康雄性 Wistar大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1．2 藥品與試劑 鹽酸法舒地爾注射液(30 mg/2 mL，天津紅日藥業(yè)股份有限公司);氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma公司，美國(guó));超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程公司)。

1．3 大鼠離體心臟Langendorff灌流模型制備 大鼠以10%水合氯醛行腹腔麻醉，固定后以3 mg/kg肝素鈉經(jīng)腹腔注射，充分肝素化后迅速開胸，取出心臟，置KH液(4℃)中修剪，迅速懸掛于Langendorff灌流系統(tǒng)上，整個(gè)過程在2 min內(nèi)。灌流溫度維持在37℃，KH液以95%的O2和5%的CO2充分飽和灌注。經(jīng)左心耳剪開左心房，將充水乳膠囊置于左心室內(nèi)，灌流平衡20 min后開始實(shí)驗(yàn)。

1．4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將60只Wistar大鼠心臟隨機(jī)分為6組:①對(duì)照(Control)組:缺血30 min，再灌注120 min，不使用藥物干預(yù)。②缺血后處理(IPO)組:缺血30 min，再灌注10 s、缺血10 s，重復(fù)6 次，然后再灌注120 min。③小劑量法舒地爾預(yù)處理(LF)組:缺血前15 min以含有1μmol/L的法舒地爾KH液灌注，隨后缺血30 min，再灌注120 min。④大劑量法舒地爾預(yù)處理(HF)組:缺血前15 min以含有10μmol/L的法舒地爾 KH液灌注，隨后缺血30 min，再灌注120 min。⑤小劑量法舒地爾預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理(LF+IPO)組:缺血前15 min以含有1μmol/L的法舒地爾KH液灌注，缺血30 min，予6次10 s的再灌注/缺血循環(huán)，隨后再灌注120 min。⑥大劑量法舒地爾預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理(HF+IPO)組:步驟同 LF+IPO組，法舒地爾劑量為10 μmol/L。

1．5 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定 采用左心室內(nèi)水囊傳遞壓力測(cè)定心室內(nèi)壓，通過MS2000生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄左心室各項(xiàng)心功能指標(biāo)，包括心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室內(nèi)壓最大上升及下降速率(+dp/dtmax，－dp/dtmax)。分別于缺血前(baseline:灌流平衡20 min時(shí))及再灌注10 min(R-10)、30 min(R-30)、120 min(R-120)時(shí)采集上述各指標(biāo)。

1．6 心肌梗死面積測(cè)定 心臟灌流結(jié)束后，從灌流裝置上取下離體心臟，放入－20℃冰箱內(nèi)冰凍1 h后取出，平行于房室溝方向，自心尖向心底將左室均勻切成等厚度的6片，將切片放入1%的TTC溶液中孵育10 min，隨后用10%的甲醛固定15 min，切面非梗死區(qū)為紅色、梗死區(qū)為灰白色。數(shù)碼相機(jī)采集圖像，用Image J圖像分析軟件分析計(jì)算心肌梗死面積，結(jié)果以此計(jì)算面積占整個(gè)心臟心肌面積的百分比表示。

1．7 SOD、MDA測(cè)定 各組選擇再灌注末時(shí)點(diǎn)作為觀察點(diǎn)，分別收集1 mL冠狀動(dòng)脈(冠脈)流出液，用分光光度計(jì)及相應(yīng)試劑盒測(cè)定SOD、MDA的水平。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以ˉx±s表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，若存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步行組間兩兩比較(SNK法)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠離體心臟左室心功能指標(biāo)比較 與Control組相比，IPO、HF、LF+IPO、HF+IPO 組的HR、LVDP、±dp/dtmax明顯升高(P 均 ＜0．05)。與IPO、HF組相比，HF+IPO 組的 HR、LVDP、±dp/dtmax明顯升高(P均＜0．05)。詳見表1。

2．2 各組大鼠離體心臟心肌梗死面積比較 Control、IPO、LF、HF、LF+IPO、HF+IPO 組心肌梗死面積分別為 45．6% ± 6．5%、34．8% ± 4．1%、43．5%±4．2%、32．1% ±3．7%、35．6% ±3．3%、24．2% ±

表1 再灌注過程中各組大鼠心臟HR、LVDP、+dp/dtmax、－dp/dtmax比較(ˉx±s)

2．8%。IPO、HF、LF+IPO、HF+IPO 組與 Control組相比，P均＜0．01;HF+IPO組與HF、IPO組相比，P均 ＜0．05。

2．3 各組大鼠離體心臟冠脈流出液中SOD活性、MDA水平比較 結(jié)果見表2。

表2 大鼠離體心臟冠脈流出液中SOD活性、MDA 水平比較(ˉx ±s)

3 討論

缺血后處理是目前預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷的主要方法之一［9～11］。有研究發(fā)現(xiàn)［12］，部分藥物如吸入性麻醉藥、腺苷等可以模擬缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)效應(yīng)，將這一方式稱為藥物預(yù)處理。Rho激酶抑制劑法舒地爾也具有藥物預(yù)處理效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，大劑量(10μmol/L)鹽酸法舒地爾預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理較單一方法干預(yù)能顯著縮小心肌梗死范圍，改善缺血/再灌注后心功能。提示大劑量法舒地爾預(yù)處理和缺血后處理這兩種干預(yù)措施可能具有協(xié)同抗心肌缺血/再灌注損傷的作用。

Demiryürek 等［8］研究證實(shí)，小劑量(0．3 mg/kg和1 mg/kg)的法舒地爾預(yù)處理對(duì)心臟無保護(hù)作用，并且會(huì)抑制缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)效應(yīng)。但大劑量(10 mg/kg)鹽酸法舒地爾預(yù)處理能改善心功能，縮小心肌梗死面積，減少心肌酶的釋放，能發(fā)揮類似缺血預(yù)處理樣的心臟保護(hù)作用。本研究也證明大劑量(10μmol/L)鹽酸法舒地爾預(yù)處理對(duì)缺血/再灌注心肌具有保護(hù)作用，而小劑量(1μmol/L)鹽酸法舒地爾預(yù)處理對(duì)心臟無明顯保護(hù)作用，并且小劑量(1μmol/L)法舒地爾預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理干預(yù)較單一方法干預(yù)不能額外縮小心肌梗死范圍以及改善缺血/再灌注后心功能，進(jìn)一步證實(shí)法舒地爾預(yù)處理對(duì)心肌保護(hù)作用可能存在一定程度的劑量依賴性。

心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為可能與氧化應(yīng)激、氧自由基、鈣超載、炎癥介質(zhì)釋放、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌纖維能量的代謝障礙及細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)。其中再灌注期間急劇增加的氧自由基與細(xì)胞膜的脂質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞是導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷的中心環(huán)節(jié)［13］。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，而SOD是清除氧自由基所必需的酶，前者水平的高低反映機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，后者水平的高低反映了機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理和大劑量鹽酸法舒地爾預(yù)處理均能顯著降低離體心臟冠脈流出液的MDA水平、升高SOD活性;大劑量(10μmol/L)鹽酸法舒地爾預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理干預(yù)較單一方法干預(yù)能顯著降低MDA水平、升高SOD活性。提示兩者可能是通過提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷的能力來發(fā)揮協(xié)同的心肌保護(hù)作用。

綜上所述，大劑量法舒地爾預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理明顯縮小缺血/再灌注心肌的梗死范圍，改善心功能，說明兩者聯(lián)合應(yīng)用在缺血/再灌注損傷中對(duì)心肌的保護(hù)作用起到疊加作用，而這一疊加作用可能是通過提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷的能力來實(shí)現(xiàn)的。兩者聯(lián)合在臨床應(yīng)用中的效果及其對(duì)心肌保護(hù)作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］Zhao ZQ，Corvera JS，Haulkos ME，et al．Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparision with ischemic preconditioning［J］．Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2003，285(2):579-588．

［2］Ma XJ，Yin HJ，Guo CY，et al．Ischemic postconditioning through percutaneous transluminal coronary angioplasty in pigs:roles of PI3K activation［J］．Coron Artery Dis，2012，23(4):245-250．

［3］Gross GJ，Gauthier KM，Moore J，et al．Evidence for role of epoxyeicosatrienoic acids in mediating ischemic preconditioning and postconditioning in dog［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(1):47-52．

［4］Liu SH，Huo YE，Yin BY，et al．Ischemic postconditioning may increase serum fetuin-A level in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction undergoing percutaneous intervention［J］．Clin Lab，2013，59(1-2):59-64．

［5］Nunes KP，Rigsby CS，Webb RC．RhoA/Rho-kinase and vascular diseases:what is the link［J］．Cell Mol Life Sci，2010，67(22):3823-3836．

［6］Hamid SA，Bower HS，Baxter GF．Rho kinase activation plays a major role as a mediator of irreversible injury in reperfused myocardium［J］．Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2007，292(6):2598-2606．

［7］Vicari RM，Chaitman B，Keefe D，et al．Efficacy and safety of fasudil in patients with stable angina:a double-blind，placebo-controlled，phase 2 trial［J］．J Am Coll Cardiol，2005，46(10):1803-1811．

［8］Demiryürek S，Kara AF，Celik A，et al．Effects of fasudil，a Rhokinase inhibitor，on myocardial preconditioning in anesthetized rats［J］．Eur J Pharmacol，2005，527(1-3):129-140．

［9］ Barrère-Lemaire S，Nargeot J，Piot C．Delayed postconditioning:not too late［J］．Trends Cardiovasc Med，2012，22(7):173-179．

［10］Maslov LN，Gorbunov AS，Lishmanov YB．Cardioprotective effect of ischemic postconditioning on the model of isolated heart［J］．Bull Exp Biol Med，2012，153(3):313-314．

［11］Granfeldt A．Organ dysfunction following regional and global ischemia/reperfusion．Intervention with postconditioning and adenocaine［J］．Dan Med J，2012，59(8):4496．

［12］Gerczuk PZ，Kloner RA．Protecting the heart from ischemia:an update on ischemic and pharmacologic conditioning［J］．Hosp Pract，2011，39(3):35-43．

［13］Su H，Ji L，Xing W，et al．Acute hyperglycaemia enhances oxidative stress and aggravates myocardial ischaemia/reperfusion injury:role of thioredoxin-interacting protein［J］．J Cell Mol Med，2013，17(1):181-191．