高尿酸血癥大鼠模型的建立及其腎臟損傷觀察

陳 瞳，崔凌凌，王希波，李長貴

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003)

高尿酸血癥是以嘌呤代謝紊亂為主的機(jī)體代謝性疾病，是導(dǎo)致痛風(fēng)、痛風(fēng)性腎病及尿酸結(jié)石的生化基礎(chǔ)，且與人體多種代謝性疾病密切相關(guān)［1，2］，如糖尿病、血脂異常、肥胖等。研究［3～5］表明，高尿酸血癥與某些腎臟、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展亦存在聯(lián)系。隨著我國社會生活水平的逐漸提高，加之部分地區(qū)高嘌呤攝入的飲食習(xí)慣，致使高尿酸血癥的發(fā)病率正在逐年升高［6～8］。動物實(shí)驗(yàn)對于開展高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制的研究、在高尿酸血癥基礎(chǔ)上引發(fā)痛風(fēng)及其他相關(guān)疾病的病理研究和治療高尿酸血癥新藥的研發(fā)具有重大意義。現(xiàn)今國內(nèi)對于高尿酸血癥動物模型的建立仍存在爭議:大鼠為動物實(shí)驗(yàn)中最常見的動物，但大鼠體內(nèi)存在尿酸酶，長期尿酸刺激會激活尿酸酶活性［9］，無法將尿酸維持在較高水平。利用抑制尿酸排泄的藥物或者尿酸酶抑制劑的藥物制備動物模型，與臨床上原發(fā)高尿酸血癥的發(fā)病病因不符，且乙胺丁醇、煙酸等尿酸排泄抑制劑對腎損害嚴(yán)重［10］，實(shí)驗(yàn)動物存活率低。酵母粉可引起機(jī)體嘌呤代謝紊亂，配合腺嘌呤灌胃可以快速升高血尿酸。而腺嘌呤對機(jī)體腎臟有很強(qiáng)毒性，尿酸升高的同時(shí)伴有腎功能損害［11］，亦不符合人體高尿酸血癥形成原理。2012年10月11日～2013年1月6日，我們用不同劑量腺嘌呤建立慢性持續(xù)性高尿酸血癥大鼠模型并觀察了其腎臟損傷情況?，F(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性 Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，飼于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物飼養(yǎng)房，實(shí)驗(yàn)開始前普通飼料飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)中大鼠自由飲食。

1．2 材料與設(shè)備 氧嗪酸鉀，羧甲基纖維素鈉，尿酸測定試劑盒，肌酐及尿素氮測定試劑盒，腺嘌呤，甲醛溶液，酵母粉飼料，全自動生化分析儀。

1．3 大鼠灌胃液的制備 將腺嘌呤用蒸餾水溶解成4 g/L的懸濁液。將羧甲基纖維素鈉粉劑用生理鹽水，配成8 g/L的乳狀溶液，再加入氧嗪酸鉀配成終濃度為25 g/L的乳懸液。

1．4 大鼠模型建立方法 大鼠普通飼料飼養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為持續(xù)高嘌呤組20只、間隔高嘌呤組20只、正常對照組10只。按參考文獻(xiàn)［12］的造模方法，持續(xù)高嘌呤組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的酵母粉飼料飼養(yǎng)，給予腺嘌呤100 mg/kg每天灌胃;間隔高嘌呤組同樣以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的酵母粉飼料飼養(yǎng)，給予腺嘌呤100 mg/kg隔天灌胃;對照組普通飼料喂養(yǎng)，并以同體積蒸餾水灌胃。于實(shí)驗(yàn)第6周調(diào)整灌胃方法:持續(xù)高嘌呤組給予腺嘌呤50 mg/kg每天灌胃;間隔高嘌呤組給予腺嘌呤50 mg/kg隔天灌胃;同時(shí)，持續(xù)高嘌呤組與間隔高嘌呤組給予100 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀，分2次(每天上午8時(shí)與下午4時(shí))腹部皮下注射，并繼續(xù)飼以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的酵母粉飼料。

1．5 各組大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮檢測 于模型建立過程中的第 0、2、4、6、8、10、12 周早晨，大鼠禁食14 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，內(nèi)眥靜脈采血1．5～2．0 mL，室溫靜置凝血，3 500 r/min 離心4 min，取300μL血清，用全自動生化分析儀測定尿酸、肌酐、尿素氮。

1．6 各組大鼠腎臟病理檢查 于模型建立過程中的第12周后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，摘取各組大鼠腎臟，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后制成3μm厚切片，HE染色，光鏡(×400)下觀察。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用ˉx±s表示，采用單因素方差分析作統(tǒng)計(jì)推斷，多組間比較方差齊用LSD后續(xù)處理、方差不齊用Tamhane處理。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠一般情況比較 隨造模時(shí)間的延長，腺嘌呤組大鼠飲水量逐漸增加，同時(shí)體質(zhì)量下降(見表1)，尿量逐漸增多，體毛干枯、豎立，活動減少。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較(g，ˉx±s)

2．2 各組大鼠血尿酸水平比較 結(jié)果見表2。

2．3 各組大鼠血肌酐、尿素氮水平比較 結(jié)果見表3、4。

2．4 各組大鼠腎臟組織病理變化 肉眼觀察，正常對照組大鼠腎臟表面光滑無腫脹，呈紅褐色，質(zhì)軟有光澤，切面皮、髓質(zhì)界線清晰;持續(xù)高嘌呤組大鼠腎臟明顯增大，兩腎灰白，表面呈顆粒狀，皮、髓質(zhì)交界不清;間隔高嘌呤組大鼠腎臟略大，表面散在白色斑點(diǎn)，切面皮質(zhì)變薄，髓質(zhì)可見放射狀白線，皮、髓質(zhì)交界尚清。HE染色顯示，正常對照組腎小囊腔內(nèi)未見異物沉積，腎曲小管、集合管亦未見異常改變;兩模型組腎小球萎縮、數(shù)量減少，腎小管擴(kuò)張，腎小管及間質(zhì)部位大量尿酸鹽結(jié)晶沉積，間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤，間隔高嘌呤組腎組織改變略輕，尿酸鹽沉積較少。

3 討論

表2 各組大鼠血尿酸比較［c/(μmol·L)，ˉx ±s］

表3 各組大鼠血肌酐水平比較［c/(μmol·L)，ˉx ±s］

表4 各組大鼠血尿素氮水平比較［c/(μmol·L)，ˉx±s］

動物實(shí)驗(yàn)是研究高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制及治療方法的重要途徑。建立高尿酸血癥動物模型的主要方法有以下幾種［13］:①單用腺嘌呤灌胃。②腺嘌呤灌胃加酵母飼料飼養(yǎng)。③腺嘌呤加乙胺丁醇、煙酸等抑制尿酸排泄藥物。④尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀灌胃或皮下注射。本實(shí)驗(yàn)綜合幾種常用造模方法，在酵母飼料的喂養(yǎng)環(huán)境下使用不同劑量腺嘌呤配伍氧嗪酸鉀制作高尿酸血癥大鼠模型，觀察其血尿酸水平變化及腎組織損害情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大劑量持續(xù)給予大鼠腺嘌呤灌胃，2周后即可升高血尿酸水平并保持在較高水平，但大鼠一般情況較差，體質(zhì)量明顯下降，且出現(xiàn)腎功能的改變;而間隔給予大鼠低劑量腺嘌呤灌胃，在升高尿酸的同時(shí)，大鼠腎功能改變小，腎組織損害出現(xiàn)晚、程度輕，大鼠體質(zhì)量等一般情況無明顯變化。人體主要靠腎臟來排泄尿酸，高劑量腺嘌呤構(gòu)建高尿酸大鼠模型與臨床常見的原發(fā)性高尿酸血癥不符，較低劑量腺嘌呤配伍氧嗪酸鉀能使尿酸升高且對腎功能改變輕，與臨床原發(fā)高尿酸血癥更相似。間隔高嘌呤組出現(xiàn)大鼠腎臟病理改變是長期血尿酸水平升高所致還是腺嘌呤對腎的毒性作用，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

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