IgA腎病大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞的變化及意義

郭 偉，馮江敏，姚 麗，劉水仙

(1沈陽市第四人民醫(yī)院，沈陽110020;2中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)

IgA腎病(IgAN)是腎小球性血尿最常見的原因，其發(fā)病機制尚未完全闡明。Noris等［1］認為，IgAN的致病動因位于骨髓細胞，故其可能是一種干細胞疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，IgAN的血管病變是影響患者預后的重要因素［2，3］，而血管病變的基礎(chǔ)是內(nèi)皮細胞損傷。內(nèi)皮祖細胞(EPCs)是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，是成年個體中與血管新生關(guān)系最為緊密的干細胞成分，參與血管損傷修復及出生后的治療性血管新生［4］。本研究觀察了 IgAN大鼠骨髓EPCs的數(shù)量和功能變化，探討EPCs在IgAN發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1．1 材料 成年雌性8周齡SD大鼠20只，體質(zhì)量200～250 g，購自沈陽陸軍總醫(yī)院實驗動物中心，隨機分為IgAN組和對照組各10只。牛血清白蛋白(BSA)，脂多糖(LPS)購自美國Ameresco公司，四氯化碳(CCl4)購自南京化學試劑有限公司，F(xiàn)ITC antirat CD34購自美國SANTA CRUZ公司，兔抗大鼠CD133多克隆抗體購自臺灣Abnova公司，PE-FLK購自美國BD biosciences公司，DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-ac-LDL)購自美國Molecular probe公司，F(xiàn)ITC標記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-1)購自美國Vtorlabs公司，CCK-8購自美國碧云天生物技術(shù)研究所，Transwell小室購自美國Corning公司。

1．2 方法

1．2．1 動物分組及模型制備 IgAN模型大鼠制備參照文獻［5］方法及預實驗，隔天灌服BSA 400 mg/kg，持續(xù)6 周;于第6、8 周分別予LPS0．25 mg/kg尾靜脈注射;皮下注射蓖麻油 0．5 mL+CCl40．1 mL，1次/周，持續(xù)9周。對照組給予等量生理鹽水灌胃、尾靜脈及皮下注射。兩組均正常進食飲水。造模結(jié)束后用代謝籠收集24 h尿液，用鄰苯三酚紅鉬酸法測24 h尿蛋白量。取血2 mL，全自動生化分析儀測定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)。取大鼠腎組織，一部分行OCT包埋，冰凍切片行免疫熒光檢測;另一部分用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，2μm厚連續(xù)切片，行HE染色。

1．2．2 EPCs的分離和培養(yǎng) 采用頸椎脫臼法處死大鼠，用密度梯度離心法獲取骨髓單個核細胞，將單個核細胞接種到M199培養(yǎng)基(VEGF 10μg/L、bFGF 5μg/L、EGF 5 μg/L、IGF 5 μg/L、10%胎牛血清)培養(yǎng)3 d，PBS液洗掉非貼壁細胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1．2．3 細胞染色 取培養(yǎng)14 d貼壁細胞與DiL-LDL(終濃度為2．4 mg/L)，37℃孵育l h，多聚甲醛固定后，再加FITC-UEA-I(終濃度為10 mg/L)37℃孵育1 h，于顯微鏡下觀察計數(shù)，攝取Dil-LDL并結(jié)合FITC-UEA-I即染色雙陽性者為正在分化的EPCs。

1．2．4 EPCs的表面抗原鑒定 收集貼壁細胞，制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度1×107/mL。取細胞懸液100μL于流式管中，加入1μg一抗(CD34、CD133、FLK-1)，加入熒光標記二抗1μg(CD34自帶熒光標簽不需加二抗)，上流式細胞儀檢測。

1．2．5 EPCs遷移能力檢測 常規(guī)胰酶消化細胞，將細胞稀釋成5．0×105/mL的細胞懸液。24孔培養(yǎng)板中加入500μL含生長因子完全培養(yǎng)基，將transwell小室至24孔板上，上室內(nèi)接種5．0×104個細胞，培養(yǎng)過夜。次日將小室取出，放入4%多聚甲醛固定細胞2 min，用棉簽輕輕將小室上室內(nèi)細胞擦去，加入蘇木素染色5 min，蒸餾水浸泡5 min，1%鹽酸乙醇分化3 s，自來水流水返藍20 min，100倍顯微鏡下觀察，進行細胞計數(shù)。

1．2．6 EPCs增殖能力檢測 常規(guī)胰酶消化細胞，進行細胞計數(shù)，將細胞稀釋成5．0×104/mL的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL細胞懸液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在48、72 h加入10μL CCK-8試劑，置37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，450 nm處檢測各孔吸光度OD值。

1．2．7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 動物模型鑒定 造模結(jié)束后，IgAN組大鼠毛色暗，體質(zhì)量增長緩慢;24 h尿蛋白定量、血清BUN、Scr、IgA水平與對照組相比明顯增高(P均＜0．01)。見表1。HE染色可見IgAN組腎組織腎小球系膜細胞增多，系膜基質(zhì)增寬，部分腎小管上皮細胞濁腫變性，腎小管形態(tài)不規(guī)整;免疫熒光見腎小球系膜區(qū)以IgA沉積為主。對照組腎組織未見明顯異常，免疫熒光陰性。

2．2 EPCs的表型鑒定 取培養(yǎng)14 d細胞，熒光標記流式細胞儀檢測細胞表面標志物，結(jié)果顯示，表達FLK-1為(47．78±6．24)%，表達 CD34 為(38．83 ±3．67)%，表達 CD133 為(44．89 ±2．35)%，證實培養(yǎng)細胞為EPCs。

表1 兩組造模結(jié)束后體質(zhì)量、24 h尿蛋白定量及血清BUN、Scr、IgA水平比較(ˉx±s)

2．3 兩組細胞數(shù)量比較 激光共聚焦顯微鏡觀察，DiI-ac-LDL染色陽性為紅色熒光，F(xiàn)ITC-UEA-1染色陽性為綠色熒光，染色雙陽性為黃色熒光。染色雙陽性細胞被認為是正在分化的EPCs。對照組和IgAN 組的 EPCs數(shù)量分別為(42．8 ±10．5)、(28．0±8．0)/HP，組間比較 P ＜0．05。

2．4 兩組細胞增殖能力比較 細胞培養(yǎng)48 h時對照組和 IgAN 組的 OD 值分別為0．65±0．03、0．53±0．17;72 h 時兩組 OD 值分別為0．75 ±0．14、0．61 ±0．01。兩組比較 P 均 ＜0．01。

2．5 兩組細胞遷移能力比較 對照組遷移到下室的細胞數(shù)為(552±43)/LP，IgAN組為(505±30)/LP，兩組比較 P ＜0．01。

2．6 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，IgAN大鼠骨髓EPCs數(shù)量與血清BUN、Scr、IgA、24 h尿蛋白定量呈負相關(guān)(r分別為 －0．49、－0．65、－0．81、－0．95，P 均 ＜0．05)。

3 討論

IgAN是我國慢性腎衰竭重要病因之一，約25%的患者在確診后5～25年內(nèi)發(fā)展為終末期腎臟病。不同地區(qū)IgAN的發(fā)病率不同，以亞洲及澳洲發(fā)病率最高。研究認為，IgAN的發(fā)病與免疫反應(yīng)、炎癥介質(zhì)、遺傳因素等多種因素密切相關(guān)。還有學者認為，IgAN發(fā)病與骨髓干細胞有關(guān)。骨髓中主要存在3種干細胞，即造血干細胞、間充質(zhì)干細胞和EPCs。已有研究報道，造血干細胞和間充質(zhì)干細胞均參與了IgAN的發(fā)?。?～8］。EPCs是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，主要來源于臍靜脈血、成人外周血和骨髓，是成年個體中與血管新生關(guān)系最為緊密的干細胞成分［9，10］。研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)源性或外源性刺激因素作用下，EPCs可從骨髓動員釋放至外周血循環(huán)，分化為成熟血管內(nèi)皮細胞，參與人體組織器官損傷后的血管再生與修復，在受損血管恢復和缺血組織的再血管化過程中發(fā)揮重要作用［11，12］。但IgAN是否存在骨髓EPCs損傷目前尚無報道。

本研究成功制備IgAN大鼠模型，大鼠出現(xiàn)血尿、蛋白尿以及腎功能減退，腎組織病理見腎小球系膜細胞增多、系膜基質(zhì)增寬等改變，免疫熒光顯示腎小球系膜區(qū)以IgA沉積為主，符合IgAN的特征;與對照組比較，IgAN組EPCs數(shù)量減少約33%，細胞遷移能力下降約10%，增殖能力下降約18%。骨髓EPCs數(shù)量減少可能導致動員到血循環(huán)的EPCs減少，而遷移能力的下降將直接降低干細胞或EPCs的動員和歸巢能力［13］，增殖能力下降說明細胞活力降低。

腎臟微循環(huán)損傷是IgAN發(fā)生發(fā)展的重要因素，血管病變的病理生理基礎(chǔ)是血管損傷后新生內(nèi)膜過度增殖及內(nèi)皮功能不全。內(nèi)皮功能障礙的本質(zhì)是內(nèi)皮損傷和修復之間的動態(tài)平衡被破壞，傳統(tǒng)觀念認為，只能依靠損傷血管內(nèi)皮鄰近的內(nèi)皮細胞分化、增殖來參與損傷處內(nèi)皮再生。近年研究表明，血管損傷后除局部血管壁細胞參與損傷血管修復外，骨髓EPCs也可以通過歸巢、整合于受損的血管叢，直接分化為內(nèi)皮細胞家族細胞;還可以直接分泌VEGF等細胞因子，通過旁分泌的方式促進局部缺血組織的血管新生，并在此基礎(chǔ)上形成有完全功能的血管［14］。IgAN動物模型骨髓EPCs數(shù)量和功能顯著受損，內(nèi)皮細胞將無法得到及時有效的更新和損傷修復，組織缺血缺氧難以改善。組織缺血缺氧雖不是IgAN發(fā)病的始動因素，但對于疾病的持續(xù)發(fā)展有重要影響。本研究也發(fā)現(xiàn)，IgAN動物模型的腎功能、血IgA水平與骨髓EPCs數(shù)量呈負相關(guān)。另外還應(yīng)注意某些致病因素，如免疫復合物、炎癥介質(zhì)等可能對EPCs數(shù)量和功能產(chǎn)生影響，從而形成惡性循環(huán)。

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