淫羊藿素、脫水淫羊藿素對(duì)T淋巴細(xì)胞的比較研究

賴新強(qiáng)，黃秀艷，曾耀英

(暨南大學(xué)1.分析測(cè)試中心;2.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院組織移植與免疫中心，廣東 廣州 510632)

淫羊藿(Epimedium Kereanum Nakai)，系小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epimedium)植物.作為中藥，淫羊藿不僅可以補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，而且還有抗衰老、提高免疫功能、抑制腫瘤等功效［1］.淫羊藿含有多種成分，其主要活性成分為淫羊藿甙(icariin)，本研究小組前期發(fā)現(xiàn)淫羊藿甙聯(lián)合環(huán)孢菌素A能抑制移植造成的免疫排斥反應(yīng)，淫羊藿甙通常經(jīng)口服途徑進(jìn)入體內(nèi)，首先被代謝為淫羊藿次甙(icarisideⅡ)，并在膽汁中積累，后經(jīng)腸道細(xì)菌分解會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物［2-5］，主要是淫羊藿素(icaritin，ICA)與脫水淫羊藿素(anhydroicaritin，AHI).目前，關(guān)于 AHI的研究報(bào)道甚少，只有體外促分化［6-7］、礦化［8］，抗氧化［9］等研究，本研究為比較兩種代謝產(chǎn)物對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響.

1 材料和方法

1.1 主要材料

清潔級(jí)BALB/c近交系小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量(18～22)g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物證號(hào):SCXK(粵)2008-0002.脫水淫羊藿素、淫羊藿素購(gòu)自北京珅奧基醫(yī)藥科技有限公司.刀豆蛋白(concanavalin A，con A)、鈣離子刺激劑 ionomycin(ION)、thapsigargin(TG)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司.RPM I 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、L-谷氨酰胺(glutamine，Gln)、β-二巰基乙醇(2-mercapto-ethanol)、質(zhì)量濃度均為100 mg/L青霉素與鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco-BRL公司.細(xì)胞周期染液PI/RNase，抗小鼠 CD3-PE、CD3-FITC、CD69-FITC、CD25-PE單克隆抗體(mAb)，Cytometric Bead Array(CBA)Mouse Inflammation Kit購(gòu)自美國(guó)BD-PharM-ingen公司.CCK-8試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司.FACSAria流式細(xì)胞儀為美國(guó)Becton Dickinson產(chǎn)品.鈣離子指示劑Fluo4-AM和助溶劑Pluronic F-127，細(xì)胞增殖染料Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司.

1.2 主要方法

(1)小鼠淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 分離BALB/c小鼠淋巴結(jié)，研磨，通過(guò)200目尼龍網(wǎng)得到單個(gè)細(xì)胞.用PBS洗滌細(xì)胞2次，計(jì)數(shù)，重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，質(zhì)量濃度均為100 mg/mL青霉素、鏈霉素，濃度為2 mmol/L L-谷氨酰胺和濃度為50 μmol/L 2-巰基乙醇).淋巴細(xì)胞接種到96孔板(200 μL/孔，密度為3×106/mL)，37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng).

(2)AHI、ICA對(duì)淋巴細(xì)胞毒性的檢測(cè) 分別設(shè)置2個(gè)對(duì)照組:空白對(duì)照組(單純RPMI1640完全培養(yǎng)基)、對(duì)照組(細(xì)胞懸液未加藥物刺激);設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組:加藥組(終濃度分別為2.5、5、10 μmol/L的AHI、ICA);且每組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù).細(xì)胞接種，分別加入50 μL不同濃度的AHI、ICA(終濃度為2.5、5、10 μmol/L)，每孔的總體積為100 μL，培養(yǎng)48 h后，按照試劑盒說(shuō)明書，每孔加入10 μL的CCK-8，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;酶標(biāo)儀檢測(cè)(單波長(zhǎng)450 nm，中速，10 s)，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率.細(xì)胞相對(duì)存活率=［(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)］×100%.

(3)AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞早期活化的檢測(cè)分別設(shè)置對(duì)照組(細(xì)胞懸液未加藥物刺激)、conA組、conA+2.5 μmol/L 組、conA+5 μmol/L 組、conA+10 μmol/L組，其中 conA的終質(zhì)量濃度均為5 mg/L，且每組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù).細(xì)胞接種，分別加入100 μL 不同濃度的 AHI、ICA(終濃度為 2.5、5、10 μmol/L)，每孔的總體積為200 μL，培養(yǎng)4 h，加入conA(終質(zhì)量濃度為5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌，轉(zhuǎn)入流式管中，加入抗小鼠CD3-PE、CD69-FITC單克隆抗體，避光染色30 min，洗滌，重懸后立即行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析 CD3 CD69雙陽(yáng)性細(xì)胞群的百分?jǐn)?shù).

(4)AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞中期活化的檢測(cè)分別設(shè)置對(duì)照組(細(xì)胞懸液未加藥物刺激)、conA組、conA+2.5 μmol/L 組、conA+5 μmol/L 組、conA+10 μmol/L組，其中 conA的終質(zhì)量濃度均為5 mg/L，且每組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù).細(xì)胞接種，分別加入100 μL 不同濃度的 AHI、ICA(終濃度為 2.5、5、10 μmol/L)，每孔的總體積為200 μL，培養(yǎng)4 h，加入conA(終質(zhì)量濃度為5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌，轉(zhuǎn)入流式管中，加入抗小鼠CD25-PE、CD3-FITC單克隆抗體，避光染色30 min，洗滌，重懸后立即行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析 CD3 CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞群的百分?jǐn)?shù).

(5)AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè) 1.0×107/mL淋巴細(xì)胞 CFSE(1 μmol/L)染色標(biāo)記37℃，10 min，用含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的 PBS洗2次，懸浮于完全培養(yǎng)基.分別設(shè)置對(duì)照組(細(xì)胞懸液未加藥物刺激)、conA 組、conA+2.5 μmol/L 組、conA+5 μmol/L 組、conA+10 μmol/L 組，其中 conA的終質(zhì)量濃度均為5 mg/L，且每組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù).細(xì)胞接種，分別加入100 μL不同濃度的AHI、ICA(終濃度為 2.5、5、10 μmol/L)，每孔的總體積為200 μL，培養(yǎng)4 h，加入 conA(終質(zhì)量濃度為5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h或72 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌，轉(zhuǎn)入流式管中，立即行FCM檢測(cè)和分析(FITC通道)，結(jié)果使用ModFit軟件分析.

(6)AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞周期的檢測(cè) 分別設(shè)置對(duì)照組(細(xì)胞懸液未加藥物刺激)、conA組、conA+2.5 μmol/L 組、conA+5 μmol/L 組、conA+10 μmol/L組，其中conA的終質(zhì)量濃度均為5 mg/L，且每組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù).細(xì)胞接種，分別加入100 μL 不同濃度的 AHI、ICA(終濃度為 2.5、5、10 μmol/L)，每孔的總體積為200 μL，培養(yǎng)4 h，加入conA(終質(zhì)量濃度為5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)入流式管中，體積分?jǐn)?shù)為70%酒精固定30 min以上，離心，PBS洗滌2次，加入細(xì)胞周期染液PI/RNase，避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，立即行FCM檢測(cè)和分析(PI通道)，結(jié)果使用ModF-it軟件分析.

(7)AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的檢測(cè)分離的淋巴細(xì)胞(4.0×107/mL)加入終濃度為2.5 μmol/L的鈣離子指示劑Fluo-4/AM，37℃染色30 min.然后洗2次，并重懸于無(wú)鈣的Locke's緩沖液(濃度分別為145 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2.6 mmol/LCaCl2， 1 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L HEPES-Na，及5.6 mmol/L葡萄糖用 HCl調(diào)試 pH=7.4)，細(xì)胞密度為4.0 ×106/mL.細(xì)胞預(yù)孵育藥物10 min.之后，加入 ION(濃度 2.5 μmol/L)或 TG(濃度2.5 μmol/L)刺激.細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣釋放后，加入2 mmol/L的鈣溶液，形成細(xì)胞外鈣涌入胞內(nèi).整個(gè)過(guò)程用流式細(xì)胞儀FACSCAria(Becton Dickinson)檢測(cè)，F(xiàn)luo-4的熒光發(fā)射，在FL-1通道.數(shù)據(jù)分析用軟件 FlowJo4.0(Tree Star，San Carlos，CA).

(8)AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的檢測(cè) 分別設(shè)置對(duì)照組(細(xì)胞懸液未加藥物刺激)、conA組、conA+5 μmol/L組，其中conA的終質(zhì)量濃度均為5 mg/L，且每組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù).細(xì)胞接種，分別加入200 μL終濃度為 5 μmol/L的 AHI、ICA，每孔的總體積為400 μL，培養(yǎng)4 h，加入conA(終質(zhì)量濃度為5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，取出細(xì)胞的培養(yǎng)上清50 μL，按照CBA試劑盒說(shuō)明書做標(biāo)準(zhǔn)曲線和加入試劑，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，獲得的數(shù)據(jù)用FCAP array軟件進(jìn)行分析.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AHI、ICA對(duì)淋巴細(xì)胞毒性的影響

CCK-8比色法檢測(cè)結(jié)果顯示:濃度為2.5、5、10 μmol/L的 AHI細(xì)胞存活率分別為(99.66±1.21)%，(98.44 ±1.51)%，(97.31 ±0.37)%，與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;2.5、5、10 μmol/L 的ICA 細(xì)胞存活率分別為(98.69 ±1.33)%，(97.18±1.54)%，(95.80 ±0.21)%，與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明AHI、ICA藥物在設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)對(duì)淋巴細(xì)胞無(wú)明顯的毒副作用.

2.2 AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞活化的影響

結(jié)果顯示:與conA組比較，各種濃度的AHI能明顯抑制T淋巴細(xì)胞的早期活化(CD3+CD69+)，且呈劑量依賴關(guān)系;各種濃度的ICA能顯著抑制T淋巴細(xì)胞的早期活化.與conA組比較，高濃度的AHI能抑制T淋巴細(xì)胞的中期活化(CD3+CD25+);各種濃度的ICA能顯著抑制T淋巴細(xì)胞的中期活化，且呈劑量依賴關(guān)系，結(jié)合早期活化的結(jié)果，ICA表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴關(guān)系(圖1).

圖1 AHI或ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞活化的影響Fig.1 Flow cytometry analysis of the effect of AHI/ICA on the activation of the mouse lymphocytes

2.3 AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示:與空白組比較，靜止?fàn)顟B(tài)的小鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)conA刺激48 h后，顯著增殖(P＜0.01)，與conA組比較，濃度2.5 μmol/L的 AHI無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，濃度5 μmol/L的AHI能抑制T細(xì)胞增殖(P＜0.05)，濃度 10 μmol/L 的 AHI能顯著抑制 T 細(xì)胞增殖(P＜0.01)，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性;濃度2.5 μmol/L的 ICA 能抑制 T 細(xì)胞增殖(P ＜0.05)，濃度5、10 μmol/L的ICA均能顯著抑制T細(xì)胞增殖(P＜0.01)，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性.72 h后，與conA組比較，濃度2.5 μmol/L的 AHI仍沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，濃度5 μmol/L的AHI繼續(xù)抑制T細(xì)胞增殖(P ＜0.05)，濃度 10 μmol/L 的 AHI繼續(xù)顯著抑制T細(xì)胞增殖(P＜0.01)，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性;濃度2.5 μmol/L的ICA沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，濃度5 μmol/L的ICA繼續(xù)抑制T細(xì)胞增殖(P＜0.05)，濃度10 μmol/L的ICA繼續(xù)顯著抑制T細(xì)胞增殖(P＜0.01)，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性(圖2).

圖2 AHI或ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Proliferation index of lymphocytes for CFSEstaining in response to conA for 48 h or 72 h

2.4 AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞周期的影響

結(jié)果顯示:與空白組比較，靜止?fàn)顟B(tài)的小鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)conA刺激48 h后，G0/G1期細(xì)胞含量顯著下降(P ＜0.01)，與 conA 組比較，濃度 2.5、5 μmol/L的AHI沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，濃度10 μmol/L的AHI能阻滯在G0/G1 期(P ＜0.05);濃度2.5 μmol/L 的ICA沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，濃度5 μmol/L的ICA能阻滯在 G0/G1期(P ＜0.05)，濃度10 μmol/L 的 ICA 能顯著阻滯在G0/G1期(P＜0.01)，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性(圖3).

2.5 AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的影響

由圖4顯示，在無(wú)鈣情況下，阻斷劑TG，離子霉素ION都會(huì)引起鈣庫(kù)釋放.隨著鈣庫(kù)清空，鈣水平恢復(fù)到基礎(chǔ)值.添加鈣離子后，胞外鈣通過(guò)開(kāi)放的鈣離子通道進(jìn)入，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣水平顯著升高.與對(duì)照組比較，5 μmol/L AHI預(yù)處理抑制鈣庫(kù)釋放不明顯，主要抑制ION刺激后的外鈣內(nèi)流過(guò)程(P＜0.05);5 μmol/L ICA預(yù)處理能顯著抑制TG或ION刺激的鈣庫(kù)釋放，以及外鈣內(nèi)流過(guò)程(P＜0.01).

圖3 AHI或ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞周期的影響Fig.3 Incubation of different concentrations of AHI/ICA for 48 h induced G0/G1 phase cell cycle Proliferation index of lymphocytes for CFSEstaining in response to conA for 48 h or 72 h arrest in conA-induced lymphocytes

圖4 AHI或ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的影響Fig.4 Effects of AHI/ICA on different stirnuli-induced Ca2+release from intracellular stores(first peak)and Ca2+influx(second influx)

2.6 AHI、ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

由 CBA 的標(biāo)準(zhǔn)品所得的 IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF和IL-12p70 5種細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，并分別計(jì)算5種細(xì)胞因子的釋放量.結(jié)果由圖5顯示:與空白組比較，conA刺激分泌的各種細(xì)胞因子顯著增高(P＜0.01);與 conA組比較，5 μmol/L的AHI能抑制活化淋巴細(xì)胞分泌IL-6(P＜0.05)、IL-10(P＜0.05)，AHI能顯著抑制活化T淋巴細(xì)胞分泌 IFN-γ(P ＜0.01)、TNF(P ＜0.01)和 IL-12p70(P＜0.01);5 μmol/L的ICA能抑制活化淋巴細(xì)胞分泌 IL-6(P ＜0.05)、IL-10(P ＜0.05)，ICA 能顯著抑制活化T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ(P＜0.01)、TNF(P ＜0.01)和 IL-12p70(P ＜0.01).

圖5 AHI或ICA對(duì)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Fig.5 CBA analysis of the effect of AHI/ICA on inflammatory cytokines secretion from conA-stimulated lymphocytes

3 討論

本研究的結(jié)果顯示脫水淫羊藿素(AHI)與淫羊藿素(ICA)對(duì)活化的小鼠T淋巴細(xì)胞具有明顯的免疫抑制作用，特別是ICA，能明顯抑制經(jīng)con A刺激的T淋巴細(xì)胞早中期活化，增殖，鈣離子內(nèi)流，并阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期，以及分泌IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF和IL-12p70 5種細(xì)胞因子.

T淋巴細(xì)胞的活化涉及許多分子的表達(dá)，其中CD69是早期活化分子.CD69一旦表達(dá)，將作為T細(xì)胞活化和增殖的共刺激分子［10］.CD25是T細(xì)胞中期活化分子，也是IL-2受體(IL-2R)α鏈，與IL-2Rβ、IL-2Rγ鏈共同組成 IL-2R，，與 IL-2結(jié)合后刺激活化的 T 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增［11］.Li等［12］研究了 ICA對(duì)脾臟T細(xì)胞活化的影響，無(wú)論是用conA，還是用anti-CD3刺激，發(fā)現(xiàn)ICA均能減少CD4+T細(xì)胞的CD25水平(P＜0.05).本研究結(jié)果表明:ICA能顯著抑制T淋巴細(xì)胞的中期活化，呈濃度依賴關(guān)系，結(jié)果與Li等的一致.本實(shí)驗(yàn)中，ICA還能顯著抑制T淋巴細(xì)胞的早期活化，結(jié)合中期活化的結(jié)果，ICA表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴關(guān)系;而AHI只能明顯抑制T淋巴細(xì)胞的早期活化，且呈濃度依賴關(guān)系.

Li等［12］研究了 ICA對(duì)脾臟 T細(xì)胞分泌 IFN-γ的影響，發(fā)現(xiàn)ICA能減少脾臟T細(xì)胞的IFN-γ水平，具有明顯的濃度依賴性.本實(shí)驗(yàn)的ICA能顯著抑制活化T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，結(jié)果與Li等的一致.Zhou等［13］比較了淫羊藿苷(icariin)和淫羊藿素(icaritin)對(duì)髓系衍生抑制細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)兩者均能減少分泌 IL-6、IL-10、TNF-α.本實(shí)驗(yàn)的ICA能抑制活化T淋巴細(xì)胞分泌IL-6、IL-10、TNF，結(jié)果與Zhou等的一致.IL-12由p35、p40兩個(gè)亞基組成，一起組成有活性的IL-12p70，IL-12對(duì)于產(chǎn)生IFN-γ是必需的，從而誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化.本實(shí)驗(yàn)的ICA能顯著抑制活化T淋巴細(xì)胞分泌IL-12p70，因此，ICA可能抑制了Th1細(xì)胞的分化，進(jìn)而顯著減少了IFN-γ，而Th2型的細(xì)胞因子IL-6，IL-10僅部分減少.據(jù)此，ICA可能通過(guò)抑制Th1細(xì)胞分化，抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，而促進(jìn)Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-10，或者促進(jìn) Tr1、Treg細(xì)胞產(chǎn)生 IL-10，增強(qiáng)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫.AHI對(duì)細(xì)胞因子的影響與ICA相似，可能具有相似的機(jī)制，需要進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)證實(shí).

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