藥用植物長(zhǎng)春花WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及表達(dá)譜分析

楊致榮，王興春，薛金愛(ài)，孟令芝，李潤(rùn)植

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷 030801

2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷 030801

3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801

WRKY 是植物特有的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子超家族，它們都含有1個(gè)或2個(gè)獨(dú)特的WRKY DNA 結(jié)合域。WRKY 域是一段由60個(gè)左右氨基酸殘基組成的多肽，因其N 端有高度保守的WRKYGQK核心序列而得名[1]。WRKY 域的C 末端是一個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)，即C2H2(氨基酸的組成模式為C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)或C2HC (氨基酸的組成模式為C-X7-C-X23-H-X1-C)[2]。WRKY 域能特異地與靶基因啟動(dòng)子 W-box 序列[2]，或 SURE(Sugar-responsive cis-element)[3]結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)的類型可將WRKY 轉(zhuǎn)錄因子分為3大類群：第1類含有2個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2型；第2和第3大類群WRKY 轉(zhuǎn)錄因子只含有1個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)分別為C2H2和C2HC型。其中第2大類群WRKY 可進(jìn)一步分為a、b、c、d 和e 等5個(gè)亞類[1]。

自從第1個(gè)WRKY基因SPF1從白薯Ipomoea batatas 中克隆后[4]，許多物種的WRKY 基因相繼被克隆和鑒定，包括擬南芥 Arabidopsis thaliana[5-6]、水稻Oryza sativa[7]、大豆Glycine max[8-9]、松樹(shù)Pinus monticola[10]、苜蓿Medicago truncatula[11]等20多種高等植物，和綠藻Pinus monticola[12-13]及兩種非植物的真核生物腸蘭伯式鞭毛蟲(chóng) Giardia lamblia 和盤(pán)基網(wǎng)柄菌Dictyostelium discoideum[13]。長(zhǎng)春花Cantharanthus roseus 既是一種優(yōu)良的園藝觀賞花卉，又是一種重要的藥用植物。因其植株體內(nèi)含有抗癌活性的長(zhǎng)春堿(Vinblastine)等70多種萜類吲哚生物堿(Terpenoid indole alkaloids，TIAs)而被廣泛應(yīng)用于抗癌藥物的提取和開(kāi)發(fā)，是目前研究TIAs 次生代謝的主要模式植物[14]。我們對(duì)長(zhǎng)春花TIAs次生代謝物合成途徑的一些主要酶蛋白基因的啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的啟動(dòng)子序列含有W-box 順式元件，暗示長(zhǎng)春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能參與TIAs 合成途徑的調(diào)控(楊致榮等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。然而，有關(guān)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能還未見(jiàn)詳盡報(bào)道。為此，我們從長(zhǎng)春花26009個(gè)蛋白中篩選和鑒定出47個(gè)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子，并用數(shù)字基因表達(dá)譜和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real time quantitative PCR，qPCR)數(shù)據(jù)對(duì)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的分類和表達(dá)譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究，深化了對(duì)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員、蛋白結(jié)構(gòu)、基因序列及其進(jìn)化的認(rèn)識(shí)。本研究為進(jìn)一步全面解析長(zhǎng)春花WRKY的功能和萜類吲哚生物堿的合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)，有利于建立優(yōu)化的代謝工程策略以實(shí)現(xiàn)抗癌長(zhǎng)春堿等目標(biāo)次生代謝物大規(guī)模生物合成和利用。

1 材料與方法

1.1 序列的收集與整理

擬南芥和長(zhǎng)春花的蛋白序列分別從擬南芥生物資源中心(The Arabidopsis Information Center，ABRC，http://www.arabidopsis.org/)及藥用基因組資源數(shù)據(jù)庫(kù)(Medicinal Plant Genomics Resource，MPGR，http://medicinalplant genomics.msu.edu/)下載。首先，將下載的序列拷貝到Notepad++軟件中進(jìn)行編輯，若某一蛋白有不同序列，選擇最長(zhǎng)的氨基酸序列；然后，將這些編輯好的蛋白序列拷貝到Excel 文件中，建成用于后續(xù)分析的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 長(zhǎng)春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的篩選和鑒定

從上述編輯好的單拷貝蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索含有WRKY 的序列，并統(tǒng)計(jì)WRKYGQK 和WRKYGKK 以及這兩個(gè)基序變異序列WRKYGEK 和WRKYGSK 的數(shù)目，從而初步確定 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目。為保證獲得的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子信息的準(zhǔn)確性，將已鑒定含有WRKY 基序的蛋白序列在NCBI 保守域數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI Conserved Domain Database，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)中進(jìn)行保守域分析，進(jìn)一步鑒定具有WRKY 功能域的蛋白序列。最后，再利用 PlantTFcat (http://plantgrn.noble.org/PlantTFcat/)轉(zhuǎn)錄因子在線分析工具分析這些具有WRKY 功能域的蛋白序列，進(jìn)一步驗(yàn)證其是否屬于轉(zhuǎn)錄因子。

1.3 長(zhǎng)春花及擬南芥WRKY 序列的聚類分析及比對(duì)

參照Eulgem 等[2]定義的WRKY 結(jié)構(gòu)域，以上述鑒定的長(zhǎng)春花及擬南芥WRKY 核心序列N端第10個(gè)氨基酸殘基開(kāi)始的65個(gè)氨基酸殘基為靶標(biāo)序列，運(yùn)用MEGA 5.0軟件[15]采用鄰位相連法(Neighbor-joining)進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。靴值(Bootstrap)設(shè)定為3000個(gè)重復(fù)，進(jìn)化距離采用p 距離法及每個(gè)位點(diǎn)不同氨基酸的數(shù)目進(jìn)行計(jì)算。

運(yùn)用CLUSTAL W2.1軟件[16]，將長(zhǎng)春花CrWRKY 序列的WRKY 域分別與擬南芥相應(yīng)類群WRKY 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較分析，進(jìn)而確定長(zhǎng)春花CrWRKY 的分類。將包括有N 末端WRKY結(jié)構(gòu)域(N-terminal WRKY domains，NTWD)和C 末端 WRKY 結(jié)構(gòu)域(C-terminal WRKY domains，CTWD)的WRKY 蛋白分別標(biāo)注N 末端及C 末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，以鑒定N 和C 末端WRKY 結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)。

1.4 長(zhǎng)春花CrWRKY 基序的組成分析

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的WRKY 核心序列及不同類鋅指結(jié)構(gòu)基序用MEME 4.8.0在線基序分析程序(http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)分析其保守性。具體參數(shù)選擇如下：選擇基序位點(diǎn)數(shù)量最小2次以上，最大不超過(guò)50；選擇單一基序重復(fù)次數(shù)為任何；每個(gè)基序的寬度為6～100個(gè)氨基酸殘基。

1.5 CrWRKY 的表達(dá)分析

長(zhǎng)春花基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的表達(dá)數(shù)據(jù)從MPGR 數(shù)據(jù)庫(kù)下載。對(duì)47個(gè)已鑒定的WRKY 不同組織、幼苗、原生質(zhì)體(Protoplast)、毛狀根和色氨酸脫羧酶干擾(Trptophan decarboxylase interference，TDCi)及色胺鹵化酶(RebH/F)轉(zhuǎn)基因根系利用MeJA 或YE 處理的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類及其表達(dá)譜分析。分析選用GenePattern(http://genepattern.broadinstitute.org/gp/pages/inde x.jsf)在線分析工具，參數(shù)設(shè)置為選用皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)及類平均(Average-linkage)法，無(wú)需定心(Centering)、標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization)及對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換(log transformation)處理，藍(lán)色、紅色和黑色分別表示W(wǎng)RKY 基因表達(dá)下調(diào)、上調(diào)和不受調(diào)節(jié)，顏色的深淺表示相對(duì)表達(dá)量的高低。

1.6 長(zhǎng)春花毛狀根和原生質(zhì)體培養(yǎng)以及MeJA處理

長(zhǎng)春花毛狀根的培養(yǎng)按照楊致榮等[17]描述的方法進(jìn)行。選用生長(zhǎng)良好、重量相同的無(wú)性系毛狀根為樣品用100μmol/L MeJA 處理，處理方法采用Suttipanta 等的方法[18]。長(zhǎng)春花原生質(zhì)體分離和懸浮培養(yǎng)依據(jù)Pattanaik 等[19]描述的方法進(jìn)行。毛狀根分別在處理后0、12和24 h 取樣，原生質(zhì)體分別在處理后0、6、12和24 h 取樣，隨即置于液氮中，以備后續(xù)提取RNA 之用。

1.7 總RNA 的提取和qPCR

100 mg 上述材料在液氮中研磨成粉末，用于后續(xù)RNA 提取。用DNase I 處理RNA 樣品以除去可能的DNA 殘余。cDNA 合成采用Invitrogen公司SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄體系。實(shí)時(shí)定量PCR應(yīng)用SYBR GreenⅠ試劑盒。每個(gè)96孔PCR 板上同一RNA 樣品重復(fù)3次，每處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。20μL 反應(yīng)體系含9μL cDNA 模板，10μL SYBR Green Supermix 和基因特異引物各0.5μL (終濃度230 nmol/L)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30 s；95℃5 s ，60℃20 s，40個(gè)循環(huán)。選用長(zhǎng)春花40S 核糖體蛋白S9基因(RPS9基因)作為內(nèi)參對(duì)照。以2-DDCt 方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用各CrWRKY 引物以及內(nèi)參基因引物見(jiàn)表1。

表1 定量PCR 所用引物Table 1 Primers for qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的篩選和鑒定

為鑒定長(zhǎng)春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子，我們首先從MPGR 長(zhǎng)春花蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到26009個(gè)單拷貝蛋白序列，再?gòu)闹泻Y選出62個(gè)含有WRKY 基序的蛋白。進(jìn)一步的分析表明，這62個(gè)蛋白中有45個(gè)含有WRKYGQK 核心序列，1個(gè)含有 WRKYGKK 核心序列，1個(gè)含有WRKYGRK 核心序列(表2)。這47個(gè)可認(rèn)定為候選WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子，其余15個(gè)含有WRKY 基序的蛋白C 末端序列嚴(yán)重缺失，不具有典型WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的特征。隨后的NCBI CDD 和PlantTFcat 分析進(jìn)一步證實(shí)這47個(gè)蛋白均包含WRKY 結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白(楊致榮等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。

為驗(yàn)證所獲得的47個(gè)長(zhǎng)春花CrWRKY 序列是否完整，將其全長(zhǎng)氨基酸序列與擬南芥72個(gè)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明47個(gè)CrWRKY 中序列最長(zhǎng)的為731個(gè)氨基酸殘基(Cra_locus_9152)，最短的只有105個(gè)氨基酸殘基(Cra_locus_6519)。40個(gè)CrWRKY 序列含有1個(gè)WRKY 域，其余7個(gè)包含2個(gè)WRKY 域(表2)。4個(gè)序列因C 末端序列不全，缺失C 末端的鋅指結(jié)構(gòu)域(Cra_locus_2271，Cra_locus_56567、Cra_locus_19330和Cra_locus_1702)，1個(gè)序列僅含不完全的鋅指結(jié)構(gòu)域(Cra_locus_6519)(圖1)。

2.2 長(zhǎng)春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的序列比對(duì)和分類

圖1 CrWRKY 和代表性AtWRKY 結(jié)構(gòu)域比對(duì)分析Fig.1 Alignment of multiple CrWRKY and selected AtWRKY domain sequences.Alignment was performed with Clustal W.The suffix “N” or “C” indicates the N- or C-terminal WRKY domains of a specific WRKY protein.The amino acids forming the zinc-finger motif are highlighted in yellow.The conserved WRKY amino acid signature is highlighted in grey,and gaps are marked with dashes.For Cra_locus_1702 and 18989,upper lines show WRKY motifs and partial zinc-finger motifs using 65 amino acid sequences of the WRKY domains for alignment.Whereas,lower lines show WRKY motifs and typical zinc fingers using the first 25 AA sequences of the 65 AA sequences and the downstream 39 AA sequence beginning at the 53rd AA of the 65 AA sequence in Cra_locus_1702 and at the 65th AA in Cra_locus_18989,respectively,for alignment.

以WRKY 域65個(gè)氨基酸殘基為靶序列，將47個(gè)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥已知的72個(gè)AtWRKY 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行聚類分析。含有2個(gè)WRKY 域的蛋白序列分別標(biāo)注 CTWD 及NTWD，并且分別作為獨(dú)立的WRKY 蛋白來(lái)運(yùn)算。結(jié)果表明，已鑒定的47個(gè)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子可分為3大類(圖2)。第1類群(Group 1，G1)包括11個(gè)CrWRKY 蛋白。其中7個(gè)蛋白含有2個(gè)WRKY 域，它們的NTWD 和CTWD 分別與擬南芥第1類群的N 末端群(Group 1-N，G1-N)和C 末端群(Group1-C，G1-C)聚類在一起。其余4個(gè)含一個(gè)WRKY 域的蛋白，分別與擬南芥的G1-C 類群(Cra_locus_10348，65433和43671)和G1-N 類群(Cra_locus_2271)聚類在一起。第2類群(Group 2，G2)包括31個(gè)CrWRKY 蛋白，分別與擬南芥的G2-a、G2-b、G2-c、G2-d 和G2-e 5個(gè)亞類群聚類在一起。第3類群(Group 3，G3)包括5個(gè)CrWRKY 蛋白，全部與擬南芥的G3-a 亞類聚類在一起。值得注意的是，與擬南芥WRKY 不同，目前已鑒定的長(zhǎng)春花WRKY 蛋白中還未發(fā)現(xiàn)G-3b 亞類成員(圖2)。

為驗(yàn)證上述CrWRKY 蛋白聚類分析的準(zhǔn)確性，從上述各類群中隨機(jī)選取一個(gè)擬南芥AtWRKY 蛋白和相應(yīng)類群的CrWRKY 蛋白核心域的65個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果表明同一類群中的CrWRKY 除了WRKY 基序及鋅指結(jié)構(gòu)相同外，整個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基序列存在高度相似性，而且與相應(yīng)群體的AtWRKY 具有高度同源性(圖1)。這說(shuō)明上述CrWRKY 的分類結(jié)果是正確的。

表2 長(zhǎng)春花中WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族Table 2 WRKY transcription factor families in C.roseus

續(xù)表2

圖2 長(zhǎng)春花和擬南芥WRKY 結(jié)構(gòu)域進(jìn)化關(guān)系系統(tǒng)樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree representing relationship among WRKY domains of C.roeus and Arabidopsis thaliana.The amino acid sequences of the WRKY domain of all CrWRKY and AtWRKY proteins were aligned with ClustalW and the phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method in MEGA 5.0.Group 1 proteins with the suffix“N” or “C” indicates the N-terminal WRKY domains or the C-terminal WRKY domains.The leaf labels of WRKY members from C.roeus (Cra_locus_Nos) and Arabidopsis (AtWRKYs) are denoted in red and blue respectively.The WRKYs with similar structure clustered together are indicated by filled circle.

2.3 CrWRKY 家族WRKY 基序和鋅指結(jié)構(gòu)的保守性與多樣性

將CrWRKY 結(jié)構(gòu)域中包括WRKY 基序的25個(gè)氨基酸殘基及鋅指結(jié)構(gòu)的35個(gè)氨基酸殘基分別運(yùn)用MEME 4.8.0在線軟件分析，以檢測(cè)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族中WRKY 基序和鋅指結(jié)構(gòu)的保守性與多樣性。如圖3所示，WRKYGQK基序在CrWRKY 不同成員中是高度保守的，僅在G2-c 中發(fā)現(xiàn)一些變異序列(WRKYGRK 和WRKYGKK)。與WRKY 基序高度保守性不同，鋅指結(jié)構(gòu)在不同類群CrWRKY 中差異較大。第1和第2類群成員的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，其中G1-N 鋅指結(jié)構(gòu)的序列為 C-X4-C-X22-H-X1-H(圖4A)，G1-C 和 G2-c 鋅指結(jié)構(gòu)序列為C-X4-C-X23-H-X1-H (圖4B)，而G2-a、G2-b、G2-d和G2-e 的序列均為C-X5-C-X23-H-X1-H (圖4C)。第3類群成員的鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC 型，序列為C-X7-C-X23-H-X1-C (表2，圖4D)。需指出的是，Cra_locus_2271、56567、19330和17024個(gè)CrWRKY 蛋白現(xiàn)有序列缺少C 末端序列，因而未檢出典型的鋅指結(jié)構(gòu)。需進(jìn)一步對(duì)其DNA 和RNA 進(jìn)行測(cè)序來(lái)分析這4個(gè)CrWRKY 蛋白的完整序列。Cra_locus_6519蛋白序列僅含有典型鋅指結(jié)構(gòu)的部分基序(缺少C 氨基酸殘基)(圖1)。

圖347 個(gè)CrWRKY 蛋白的WRKY 基序Fig.3 Conserved WRKY motifs in 47 CrWRKY proteins.The CrWRKY sequence used for alignment was 25 AA in length containing WRKY motifs.The bit score indicates the frequency of the amino acids at each position in the sequences.

圖447 個(gè)CrWRKY 蛋白鋅指結(jié)構(gòu)的保守性和多樣性Fig.4 Conservation and diversity of the zinc-finger motifs in 47 CrWRKY proteins.The CrWRKY sequence used for alignment was 35 AA in length containing zinc-finger motifs.The bit score indicates the frequency of the amino acids at each position in the sequences.

2.4 CrWRKY 的表達(dá)譜

基因表達(dá)模式的分析是鑒定基因功能的重要手段。為深入了解各CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能，我們從MPGR 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了47個(gè)CrWRKY 基因已有的表達(dá)數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)包括CrWRKY 在長(zhǎng)春花根、毛狀根、莖、葉和花等不同器官，TDCi 及RebH/F 轉(zhuǎn)基因毛狀根系，以及MeJA 和YE 處理的幼苗、毛狀根和原生質(zhì)體中的表達(dá)數(shù)據(jù)。系統(tǒng)聚類和表達(dá)譜分析表明，CrWRKY 基因的表達(dá)具有器官特異性(圖5)。在根中高表達(dá)的有9個(gè)，其中3個(gè)顯著高表達(dá)(Cra_locus_6519、2271和3799)。20個(gè)CrWRKY在莖中高表達(dá)，其中10個(gè)(Cra_locus_6519、17347和4234等)顯著高表達(dá)，4個(gè)(Cra_locus_1311、3760、20290和2950)為莖特異高表達(dá)。葉片中高表達(dá)的有7個(gè)，其中3個(gè)(Cra_locus_19359、70197和4234)為顯著高表達(dá)，僅Cra_locus_70197為葉片特異高表達(dá)?；ㄆ鞴儆?個(gè)顯著高表達(dá)的 CrWRKY，其中Cra_locus_8145、549和18915為花特異表達(dá)。僅Cra_locus_4234在根、莖和葉片中均表達(dá)。

毛狀根是長(zhǎng)春花等一些藥用植物合成積累萜類吲哚生物堿等次生代謝的重要器官。對(duì)CrWRKY 基因在長(zhǎng)春花野生型和兩種轉(zhuǎn)基因毛狀根(TDCi 和RebH)中表達(dá)數(shù)據(jù)分析表明，超過(guò)半數(shù)的 CrWRKY 成員在毛狀根中高表達(dá)(圖5)。如野生型毛狀根中高表達(dá)的CrWRKY 有23個(gè)，TDCi 的轉(zhuǎn)基因毛狀根中26個(gè)CrWRKY高表達(dá)，RebH 轉(zhuǎn)基因毛狀根在MeJA 處理后高表達(dá)的CrWRKY 達(dá)29個(gè)。在這3種毛狀根中均高表達(dá)的CrWRKY 有11個(gè)。MeJA 處理引起野生型毛狀根中CrWRKY 上升表達(dá)有11個(gè)，減低表達(dá)的有12個(gè)。TDCi 毛狀根經(jīng)MeJA 處理后，上升表達(dá)的CrWRKY 為6個(gè)，下降表達(dá)的有11個(gè)。可見(jiàn)MeJA 處理即可上調(diào)也可下調(diào)CrWRKY在毛狀根中的表達(dá)，而且下調(diào)表達(dá)的多于上調(diào)表達(dá)的。在原生質(zhì)體中高表達(dá)的CrWRKY 有8個(gè)，MeJA 處理導(dǎo)致CrWRKY 上升表達(dá)有10個(gè)，下降表達(dá)的有3個(gè)。YE 處理原生質(zhì)體則誘導(dǎo)11個(gè)CrWRKY 上升表達(dá)，僅2個(gè)下降表達(dá)。與MeJA處理毛狀根對(duì)CrWRKY 表達(dá)影響不同，MeJA 和YE 處理原生質(zhì)體誘導(dǎo)CrWRKY 上升表達(dá)的數(shù)目明顯高于下降表達(dá)的。

表達(dá)譜系統(tǒng)聚類分析將47個(gè)CrWRKY 表達(dá)譜劃分為3種不同表達(dá)模式(圖5)：第1組(Group 1) CrWRKY 主要在花和MeJA 或YE 處理的懸浮培養(yǎng)的原生質(zhì)體中高表達(dá)，如Cra_locus_13321、22725和10348等；第2組(Group 2) CrWRKY 蛋白主要在莖、毛狀根(野生型毛根、轉(zhuǎn)基因TDCi 毛根和轉(zhuǎn)基因RebH/F毛根)和受MeJA 處理的毛狀根中高表達(dá)(如Cra_locus_1311、6088、11684、16307、21821和2950等)，其中少數(shù)在原生質(zhì)體中高表達(dá)且受MeJA 誘導(dǎo)(如Cra_locus_5497、19330和22395等)；第3組(Group 3)主要在根、莖、葉、幼苗和毛狀根及受MeJA 處理的毛狀根中高表達(dá)，但在原生質(zhì)體中低表達(dá)且不受MeJA 誘導(dǎo)(如Cra_locus_6519、17347和7867等)。

圖5 長(zhǎng)春花中的47個(gè)CrWRKY 基因在不同組織器官和不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)譜聚類分析Fig.5 Hierarchical clustering and expression profiles of the 47 CrWRKYs in different organs/tissues and under various treatments in C.roseus.Blocks with colors indicate low/down expression (blue),high/up expression (red) or no expression/no change (black).WT,wild-type;RebH,flavin-dependent halogenase;TDCi:tryptophan decarboxylase gene silenced by RNAi.

進(jìn)一步的分析表明，部分蛋白序列聚類在一起的CrWRKY 成員，其表達(dá)模式也類似，但不完全吻合。 G2-c 亞類 CrWRKY 的Cra_locus_105225、22395和19330的表達(dá)譜極相似，同劃在第2組表達(dá)模式。G2-c 的Cra_locus_43896和37309表達(dá)譜相近，劃在第3組表達(dá)模式。 G2-e 亞類 CrWRKY 的Cra_locus_21821和16307表達(dá)譜亦相似，劃在第2組表達(dá)模式。表達(dá)譜相似的 G1大類CrWRKY 的Cra_locus_549和8145劃在第1組表達(dá)模式。但同在G1大類群的Cra_locus_13321、9152和4234的表達(dá)模式分別劃分在第1、2和3組。

2.5 CrWRKY 表達(dá)模式的驗(yàn)證

為驗(yàn)證上述基于數(shù)據(jù)庫(kù)已有表達(dá)數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析所揭示的CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式，我們先選取5個(gè)在不同器官表達(dá)差異較大的CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)它們的表達(dá)情況。其中 Cra_locus_2271、Cra_locus_20290、 Cra_locus_70197和Cra_locus_8145分別在根、莖、葉和花器官顯著高表達(dá)。定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，這4個(gè)CrWRKY 在所檢測(cè)器官中表達(dá)量高低與上文數(shù)字基因表達(dá)譜表達(dá)分析結(jié)果基本一致(圖6A)。數(shù)字基因表達(dá)譜和定量 PCR 數(shù)據(jù)均顯示Cra_locus_1702在根和莖中表達(dá)量相似，盡管表達(dá)量不是很高，但顯著高于在葉片和花中的表達(dá)(圖5和6A)。

上述數(shù)字基因表達(dá)譜分析還顯示，許多CrWRKY 基因的表達(dá)受MeJA 和YE 的調(diào)控。為驗(yàn)證這些CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式，我們用MeJA 分別處理長(zhǎng)春花原生質(zhì)體和無(wú)性系毛狀根。原生質(zhì)體分別在處理后0、6、12和24 h 取樣。無(wú)性系毛狀根在處理后0、12和24 h 取樣。提取總RNA，用qPCR 檢測(cè)所選取的CrWRKY基因的表達(dá)情況。用qPCR 檢測(cè)MeJA 處理原生質(zhì)體樣品中 Cra_locus_13321、24943、1311、13263、18989和8670等6個(gè)CrWRKY 基因表達(dá)的結(jié)果表明，Cra_locus_13321、24943、1311、13263、18989五個(gè)基因受MeJA 誘導(dǎo)，它們的表達(dá)模式基本與數(shù)字基因表達(dá)譜所揭示一致，其表達(dá)峰值和時(shí)態(tài)變化有較大差異。而數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析表明Cra_locus_8670不受MeJA 的影響，qPCR 結(jié)果表明該基因受MeJA 誘導(dǎo)，呈上升表達(dá)，但上升幅度很小(圖6B)。依據(jù)數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從毛狀根受MeJA 誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)生變化的CrWRKY 基因中，分別選取3個(gè)上升表達(dá)(Cra_locus_24943、11684和30069)和減低表達(dá)(Cra_locus_9152、6519和19580) WRKY 基因作為檢測(cè)靶標(biāo)。如圖6C 所示，與數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果不同，MeJA 處理毛狀根并未引起Cra_locus_30069上升表達(dá)和Cra_locus_19580下降表達(dá)，而是導(dǎo)致2個(gè)CrWRKY 呈現(xiàn)相反表達(dá)模式。其余4個(gè)CrWRKY 基因受MeJA 影響，在毛狀根中表達(dá)量發(fā)生顯著變化，表達(dá)模式與數(shù)字基因表達(dá)譜分析所揭示的基本一致。

3 討論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族含有眾多成員，其蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能具有多樣性。鑒定WRKY 轉(zhuǎn)錄因子種類及數(shù)量是深入研究其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。本研究從長(zhǎng)春花的26009個(gè)蛋白中篩選鑒定出47個(gè)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子(表2，圖2)，約占蛋白總數(shù)的0.18%。而在擬南芥(72個(gè))、水稻(109個(gè))和玉米(136個(gè))基因組中這一比例分別為0.26%、0.41%和0.42%。無(wú)論從WRKY的總數(shù)還是所占比例來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)春花都遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于上述3種植物。這可能是在進(jìn)化過(guò)程中擬南芥、水稻和玉米基因組中WRKY 基因發(fā)生了更多的基因復(fù)制事件，導(dǎo)致WRKY 基因的快速擴(kuò)張[12,20]，而在長(zhǎng)春花中CrWRKY 基因單拷貝居多。但由于長(zhǎng)春花全基因組測(cè)序還未完成，因此不排除一些CrWRKY 基因還未被發(fā)現(xiàn)的可能。

圖6 代表性CrWRKY 基因表達(dá)模式的qPCR 驗(yàn)證Fig.6 Expression verification of the selected CrWRKY genes revealed by qPCR.(A) Expression patterns of five selected CrWRKY genes in various organs.(B) Expression patterns of six selected CrWRKY genes in MeJA-treated protoplasts.(C) Expression patterns of six selected CrWRKY genes in MeJA-treated hair roots.For real-time PCR,the relative expression of mRNA (y-axis) was calculated according to the description in materials and methods.The RPS9 gene was used as an internal control to normalize the data.Error bars are standard deviations of three biological replicates.Stars above the bars indicate statistically significant increases or decreases compared with the un-treated control (P<0.05,t test).

依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)，高等植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族一般分為3個(gè)大類和8個(gè)亞類[1,11]，本研究通過(guò)與擬南芥AtWRKY 蛋白序列比較，以及系統(tǒng)聚類和WRKY 域基序保守性等分析，將47個(gè)CrWRKY 也分為相似的類群，即G1、G2(G2-a、b、c、d 和e)和G3(G3-a)，但無(wú)G3-b 成員(圖1、圖2及表2)。依其蛋白序列分析，推測(cè)Cra_locus_10348等3個(gè)CrWRKY 可能起源于具有2個(gè)WRKY 域的家族成員，在進(jìn)化過(guò)程中丟失1個(gè)WRKY 域。G1類群成員WRKY 域丟失的現(xiàn)象也在擬南芥和玉米等基因組中發(fā)生。如擬南芥G1成員AtWRKY10只包括1個(gè)WRKY域[20]，玉米G1類群中16個(gè)成員僅含有1個(gè)WRKY 域[21]。有關(guān)WRKY 家族進(jìn)化研究認(rèn)為，編碼1個(gè)WRKY 域的基因是從編碼2個(gè)WRKY域的基因進(jìn)化而來(lái)，且C 末端WRKY 域相當(dāng)保守，在決定DNA 結(jié)合過(guò)程中起主導(dǎo)作用[12]。換句話說(shuō)，N 末端WRKY 域在進(jìn)化過(guò)程中常發(fā)生丟失。這也可解釋，已檢測(cè)WRKY 基因的高等植物中，具有1個(gè)WRKY 域的WRKY 蛋白數(shù)量遠(yuǎn)大于具有2個(gè)WRKY 域蛋白數(shù)量。

擬南芥和水稻等植物的G3類群WRKY不僅數(shù)目多(擬南芥11個(gè)，占20%和水稻36個(gè)，占30%)，而且基因擴(kuò)增明顯。例如，水稻G3-a 和G3-b 分別有10和26個(gè)OsWRKY 成員[12]，且WRKY 域保守序列變異大于G1和G2類群的OsWRKY。G3類群的OsWRKY 擴(kuò)增與基因復(fù)制相關(guān)。Zhang 等[13]報(bào)道，在單、雙子葉植物發(fā)生歧化(約160 Mya 前)后，G3類群WRKY 開(kāi)始獨(dú)立復(fù)制。Ling 等[20]進(jìn)一步證實(shí)，擬南芥、水稻和大豆的G3類群WRKY的擴(kuò)增是進(jìn)化上近期(24～40 Mya)基因組復(fù)制的結(jié)果。與之不同的是，長(zhǎng)春花CrWRKY G3類群僅有5個(gè)成員，全聚類為G3-a 亞類。顯然，長(zhǎng)春花G3類群WRKY無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象，這與黃瓜基因組中G3類群WRKY(6個(gè)成員)情形類似[20]。類似的，裸子植物松樹(shù)Pinus monticola 中編碼83個(gè)PmWRKY 蛋白，但亦未檢出G3類群成員[10]。可見(jiàn)，G3類群WRKY 在植物進(jìn)化過(guò)程中變異較大，暗示了在不同種屬植物中該類群成員的功能有較高的歧化性。

此外，對(duì)47個(gè)CrWRKY 蛋白的WRKY 域保守基序的分析顯示，WRKYGQK 是WRKY 基因最保守的基序，僅在G2-c 中發(fā)現(xiàn)一些變異序列(如WRKYGRK 和WRKYGKK)(圖1)。然而，鋅指結(jié)構(gòu)基序在序列長(zhǎng)短和結(jié)構(gòu)上差異較大。與其他類群CrWRKY 蛋白C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)不同，G3類群WRKY 鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC 型。這反映了不同類型的WRKY 基因的所經(jīng)歷選擇壓力和進(jìn)化模式是不同的。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御多種生物脅迫和逆境反應(yīng)中起著重要的作用[22-24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，約1/3 CrWRKY 基因的表達(dá)受MeJA 和YE調(diào)控。大量研究表明，YE 能誘導(dǎo)多種參與植物抵御病原菌侵襲的基因表達(dá)，而MeJA 直接參與植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)。眾多CrWRKY 的表達(dá)受MeJA 和YE 調(diào)控，預(yù)示著這些CrWRKY 可能參與長(zhǎng)春花植株抵御病原菌等生物脅迫以及非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，這些CrWRKY 亦可能在長(zhǎng)春花萜類吲哚生物堿(TIAs)的生物合成及代謝中起重要作用，因?yàn)殚L(zhǎng)春花萜類吲哚堿的生物合成受YE 和MeJA等植物激素誘導(dǎo)。最近，Suttipanta 等[25]克隆和鑒定了一個(gè)長(zhǎng)春花WRKY 轉(zhuǎn)錄因子CrWRKY1(即本文的Cra_locus_16284)，該WRKY 在根中特異高表達(dá)，且受MeJA、赤霉素和乙烯的誘導(dǎo)，過(guò)量表達(dá)CrWRKY1使根中蛇根堿的含量提高了3倍多。這與本文該轉(zhuǎn)錄因子主要在毛狀根中高表達(dá)和受MeJA 誘導(dǎo)的研究結(jié)果一致。

如上所述毛狀根是長(zhǎng)春花等一些藥用植物合成積累萜類吲哚生物堿等次生代謝物的重要器官，而且長(zhǎng)春花遺傳轉(zhuǎn)化體系目前多采用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根體系。因此，分析長(zhǎng)春花毛狀根中CrWRKY 表達(dá)譜有助于認(rèn)識(shí)毛狀根中萜類吲哚生物堿等次生代謝物合成調(diào)控機(jī)制。TDC是萜類吲哚生物堿生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化色氨酸生成萜類吲哚生物堿生物合成的起始底物即色胺。RebH/F 是催化色胺生成鹵代色胺(另一種供生物堿合成的前體物質(zhì))的關(guān)鍵酶。長(zhǎng)春花TDCi 轉(zhuǎn)基因毛狀根是RNA 介導(dǎo)TDC 基因沉默的毛狀根，該毛狀根中色胺含量明顯減少。長(zhǎng)春花RebH/F 轉(zhuǎn)基因毛狀根能合成鹵代色胺。顯然這兩種長(zhǎng)春花轉(zhuǎn)基因毛狀根中用于生物堿生物合成的前體物質(zhì)發(fā)生較大變化。我們先期對(duì)已知的一些參與萜類吲哚生物堿生物合成的關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有啟動(dòng)子都含WRKY 轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的元件W-box，其中TDC 啟動(dòng)子包含有4個(gè)W-box，這暗示長(zhǎng)春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能參與TIAs 合成途徑的調(diào)控。為此，本文比較分析野生型毛狀根與這兩種轉(zhuǎn)基因毛狀根中CrWRKY 基因表達(dá)譜，以期進(jìn)一步解析CrWRKY 參與萜類吲哚生物堿生物合成的調(diào)控作用，為發(fā)現(xiàn)更多的參與調(diào)控萜類吲哚生物堿生物合成的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，特別是響應(yīng)體內(nèi)不同前體物質(zhì)的WRKY 提供科學(xué)依據(jù)。表達(dá)譜分析結(jié)果(圖5)顯示，除了少數(shù)CrWRKY (如Cra_locus_6519和 Cra_locus_16307等)在這3種毛狀根中均高表達(dá)外，多數(shù)CrWRKY (如 Cra_locus_1311、Cra_locus_9152和Cra_locus_13760等)在這3種毛狀根間表達(dá)量發(fā)生顯著變化，表明這些CrWRKY 可能參與對(duì)毛狀根中生物堿生物合成的前體物質(zhì)變化的響應(yīng)以及下游某些生物堿合成積累的調(diào)控。

為進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)字基因表達(dá)譜分析所揭示的CrWRKY 表達(dá)模式，我們選取16個(gè)CrWRKY為靶標(biāo)，用qPCR 檢測(cè)它們?cè)诓煌鞴?，以及在MeJA 處理的原生質(zhì)體和毛狀根中的表達(dá)。結(jié)果顯示，絕大多數(shù)所測(cè)CrWRKY 表達(dá)模式與數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果基本吻合(圖5、6)。只有2個(gè)CrWRKY 表達(dá)模式的qPCR 和數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果不一致。這兩種表達(dá)分析數(shù)據(jù)還顯示，除CrWRKY1，其他一些CrWRKY 也可能參與TIA 生物合成途徑的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。深入研究這些CrWRKY 的生物學(xué)功能，將為全面解析長(zhǎng)春花TIAs 生物合成的調(diào)控機(jī)制和提高長(zhǎng)春花抗癌生物堿生物合成的代謝工程策略提供有益的信息。

一些研究認(rèn)為，蛋白序列結(jié)構(gòu)相近的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，常有類似的表達(dá)模式，行使相似的生物學(xué)功能[26-27]。然而，我們的表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析顯示同一類群(或亞類)的CrWRKY 成員多數(shù)的表達(dá)模式不完全一致。這意味著結(jié)構(gòu)相似的CrWRKY 成員，它們的表達(dá)模式和功能也可能是相異的。這正是WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的典型特征，即WRKY 結(jié)構(gòu)域高度保守和功能多樣性。因此，未來(lái)需進(jìn)行更多詳盡研究，以全面認(rèn)識(shí)本文所鑒定的47個(gè)CrWRKY 成員的具體生物學(xué)功能和調(diào)控靶基因或目標(biāo)代謝途徑表達(dá)的分子機(jī)理。

[1]Rushton PJ,Somssich IE,Ringler P,et al.WRKY transcription factors.Trends Plant Sci,2010,15(5):247?258.

[2]Eulgem T,Rushton PJ,Robatzek S,et al.The WRKY superfamily of plant transcription factors.Trends Plant Sci,2000,5(5):199?206.

[3]Sun C,Palmqvist S,Olsson H,et al.A novel WRKY transcription factor,SUSIBA2,participates in sugar signaling in barley by binding to the sugar-responsive elements of the iso1 promoter.Plant Cell,2003,15(9):2076?2092.

[4]Ishiguro S,Nakamura K.Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein,SPF1,that recognizes SP8 sequences in the 5'upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato.Mol Gen Genet,1994,244(6):563?571.

[5]Riechmann JL,Heard J,Martin G,et al.Arabidopsis transcription factors:genome-wide comparative analysis among eukaryotes.Science,2000,290(5499):2105?2110.

[6]Pérez-Rodríguez P,Ria?o-Pachón DM,Corrêa LGG,et al.PlnTFDB:updated content and new features of the plant transcription factor database.Nucleic Acids Res,2010,38(suppl 1):D822?D827.

[7]Goff SA,Ricke D,Lan TH,et al.A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L.ssp.japonica).Science,2002,296(5565):92?100.

[8]Zhou QY,Tian AG,Zou HF,et al.Soybean WRKY-type transcription factor genes,GmWRKY13,GmWRKY21,and GmWRKY54,confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants.Plant Biotechnol J,2008,6(5):486?503.

[9]Schmutz J,Cannon SB,Schlueter J,et al.Genome sequence of the palaeopolyploid soybean.Nature,2010,463(7278):178?183.

[10]Liu JJ,Ekramoddoullah AK.Identification and characterization of the WRKY transcription factor family in Pinus monticola.Genome,2009,52(1):77?88.

[11]Jiang T,Lin YX,Liu X,et al.Genome-wide analysis of the WRKY transcription factor family in Medicago truncatula.Acta Pratacul Sin,2011,20(3):211?218(in Chinese).江騰,林勇祥,劉雪,等.苜蓿全基因組WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的分析.草業(yè)學(xué)報(bào),2011,20(3):211?218.

[12]Wu KL,Guo ZJ,Wang HH,et al.The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins.DNA Res,2005,12(1):9?26.

[13]Zhang Y,Wang L.The WRKY transcription factor superfamily:its origin in eukaryotes and expansion in plants.BMC Evol Biol,2005,5:1?12.

[14]Zhou ML,Shao JR,Tang YX.Production and metabolic engineering of terpenoid indole alkaloids in cell cultures of the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G.Don (Madagascar periwinkle).Biotechnol Appl Biochem,2009,52(Pt 4):313?323.

[15]Tamura K,Peterson D,Peterson N,et al.MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods.Mol Biol Evol,2011,28(20):2731?2739.

[16]Larkin MA,Blackshields G,Brown NP,et al.Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatics,2007,23(21):2947?2948.

[17]Yang ZR,Wang XC,Xue JA,et al.An efficient transgenic system of Catharanthus roseus mediated by Agrobacterium rhizogens.Plant Physio J,2012,48(10):997?1004(in Chinese).楊致榮,王興春,薛金愛(ài),等.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長(zhǎng)春花高效轉(zhuǎn)基因體系的建立.植物生理學(xué)報(bào).2012,48(10):997?1004.

[18]Suttipanta N,Pattanaik S,Gunjan S,et al.Promoter analysis of the Catharanthus roseus geraniol 10-hydroxylase gene involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis.Biochim Biophys Acta,2007,1769(2):139?148.

[19]Pattanaik S,Kong Q,Zaitlin D,et al.Isolation and functional characterization of a floral tissue-specific R2R3 MYB regulator from tobacco.Planta,2010,231(5):1061?1076.

[20]Ling J,Jiang W,Zhang Y,et al.Genome-wide analysis of WRKY gene family in Cucumis sativus.BMC Genomics,2011,12:471?490.

[21]Wei KF,Chen J,Chen YF,et al.Molecular phylogenetic and expression analysis of the complete WRKY transcription factor family in maize.DNA Res,2012,19(2):153?164.

[22]Qiu YP,Yu DQ.Over-expression of the stress-induced OsWRKY45 enhances disease resistance and drought tolerance in Arabidopsis.Environ Exp Bot,2009,65(1):35?47.

[23]Jiang Y,Deyholos M.Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 and WRKY33 transcription factors in abiotic stresses.Plant Mol Biol,2009,69(1-2):91?105.

[24]Ramamoorthy R,Jiang SY,Kumar N,et al.A Comprehensive transcriptional profiling of the WRKY gene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments.Plant Cell Physiol,2008,49(6):865?879.

[25]Suttipanta N,Pattanaik S,Kulshrestha M,et al.The transcription factor CrWRKY1 positively regulates the terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus.Plant Physiol,2011,157(4):2081?2093.

[26]Li S,Fu Q,Chen L,et al.Arabidopsis thaliana WRKY25,WRKY26,and WRKY33 coordinate induction of plant thermotolerance.Planta,2011,233(6):1237?1252.

[27]Lai Z,Vinod KM,Zheng Z,et al.Roles of Arabidopsis WRKY3 and WRKY4 transcription factors in plant responses to pathogens.BMC Plant Biol,2008,8(1):1?13.