基元模式分析在生物網(wǎng)絡和途徑分析中的應用

趙權宇，于水燕，史吉平

中國科學院上海高等研究院生物煉制實驗室，上海 201210

與生物代謝網(wǎng)絡相關的系統(tǒng)生物學計算方法包括有約束代謝通量分析(Constraint-based metabolic flux analysis)和代謝途徑分析(Metabolic pathway analysis)等[1-3]。代謝途徑分析研究代謝網(wǎng)絡中從底物到產(chǎn)物的可能途徑或內(nèi)部代謝產(chǎn)物的循環(huán)。代謝途徑分析的多數(shù)算法都是以凸分析為基礎的，主要包括基元模式(Elementary mode)和極端途徑(Extreme pathway)[4]。基元模式分析允許代謝網(wǎng)絡模型中同時存在可逆和不可逆反應或傳遞過程；極端途徑分析需要把代謝網(wǎng)絡內(nèi)部的可逆反應拆分成兩個不可逆反應。關于基元模式和極端途徑的關系曾經(jīng)有過爭論，目前較為一致的看法是極端途徑為基元模式的子集[5]?；Ｊ椒治鍪菓米疃嗟拇x途徑分析方法。文中綜述了基元模式分析的最新進展，并探討了未來的重要發(fā)展方向。

1 基元模式分析的算法與軟件

基元模式是代謝網(wǎng)絡中所有可能代謝途徑的集合，基元模式的數(shù)目隨著代謝網(wǎng)絡規(guī)模的擴大急劇增加，將會引發(fā)組合爆炸(Combinatorial explosion)。對中等規(guī)模代謝網(wǎng)絡，基元模式數(shù)就可能超過200萬，而基因組尺度代謝網(wǎng)絡的基元模式很容易就超過2600萬[6]。這給基元模式的計算和分析都帶來了困難。Terzer 等[7]提出位模式樹算法加快基元模式的計算速度。其顯著特征是在正常變量中區(qū)分極端線，引入隨機排序方法加強并行計算，提出余數(shù)方法改善求秩，在硬件上使用多核技術。該算法用Java 開發(fā)，可以在Matlab 中運行，成功計算了大腸桿菌中心碳代謝網(wǎng)絡(106個反應)的2638萬個基元模式，以及基因組尺度幽門螺桿菌(381個反應)的500萬個基元模式。Jevremovic 等用C++開發(fā)的算法先對代謝網(wǎng)絡進行壓縮，再用并行計算的方法計算釀酒酵母(80個反應)的1332萬個基元模式，可以在0.5 h 左右完成[8]。這些算法還有待進一步改進，比如繼續(xù)優(yōu)化數(shù)據(jù)結(jié)構和改善求秩等。已經(jīng)證明，基元模式的計算是NP-Complete 問題(多項式復雜程度的完全非確定性問題，Non-deterministic polynomial-complete problem)[9-10]。雖然提高計算速度可以縮短計算時間，對多數(shù)研究者來說，分析1000萬個基元模式仍舊是困難的。KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫根據(jù)功能不同將代謝網(wǎng)絡分解成若干的子單元并提供代謝途徑圖，如糖酵解和三羧酸循環(huán)等。這些子單元包括的代謝反應或過程一般不會超過300個，計算子單元的基元模式是相對容易的。Schwartz等[11]最早嘗試從這些子單元分析基因組尺度釀酒酵母代謝網(wǎng)絡模型的基元模式，并結(jié)合基因表達數(shù)據(jù)分析了不同壓力條件下的代謝功能?；Ｊ阶疃嗟淖訂卧俏焯橇姿峄緩剑矁H有206個基元模式，給基元模式分析帶來很大方便。該方法雖然無法將子單元與全網(wǎng)絡尺度的基元模式建立有效的聯(lián)系，但已經(jīng)初步獲得了基因組尺度的基元模式與轉(zhuǎn)錄的關系。Kaleta 等同樣希望通過分析子系統(tǒng)來獲得基因組尺度代謝網(wǎng)絡的潛在代謝途徑[12]。他們的出發(fā)點是在子網(wǎng)絡分析中如果外部代謝物選擇不當，可能丟失一些關鍵的基元模式。因而提出基元通量趨勢(Elementary flux patterns)的概念，這些基元通量趨勢是一個子系統(tǒng)中反應的子集，代表大網(wǎng)絡每個穩(wěn)態(tài)通量分布在子系統(tǒng)上的可能途徑。目前可以考察最小培養(yǎng)基，計算最小剪切組和考察魯棒性等，進一步的研究還在進行中。另外一種策略是開發(fā)新的算法，避免計算全部的基元模式。de Figueiredo 等[13]提出的是K 次最短基元模式的算法，這里的K 不是路徑長度，而是代謝網(wǎng)絡中基元模式的路徑長度排序。比如，三羧酸循環(huán)的1次最短基元模式(K=1)的路徑長度是2。應用K次最短基元模式算法可以挑選基因組尺度大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌代謝網(wǎng)絡模型中與賴氨酸生產(chǎn)相關的基元模式的子集，如何建立K 次最短基元模式與代謝行為的關系還有待深入研究。Song 等[14]用產(chǎn)率分析算法計算基元模式的子集。將包含38個反應的重組釀酒酵母的基元模式數(shù)從369個降低到35個。他們的新算法基于凸包分析，難以用于多維體系，僅對小規(guī)模的代謝網(wǎng)絡適用。Rezola 等[15]使用了類似的策略，他們提出了產(chǎn)生通量模式(Generating flux mode)的概念，計算構成通量空間的邊。對基因組尺度(2082個反應，1668個代謝物)的大腸桿菌代謝網(wǎng)絡，該算法可以計算K 等于100的賴氨酸產(chǎn)生途徑的產(chǎn)生通量模式。該算法基于優(yōu)化方法求取凸基，缺陷是產(chǎn)生通量模式并不唯一。在隨機選定產(chǎn)生通量模式時，可能忽略關鍵的基元模式，影響對代謝網(wǎng)絡結(jié)構的解析。即使基元模式只有幾千個，手動分析這些基元模式仍是困難的。借助普通模體集聚(ACoM)可對基元模式進行聚類分析[16]，不過也僅適用于小型網(wǎng)絡。依據(jù)具體基因型和環(huán)境條件，約束代謝網(wǎng)絡空間，有助于減少基元模式數(shù)目。如Ferreira 等開發(fā)了集成環(huán)境組學數(shù)據(jù)的隱途徑投影算法(Projection to latent pathways)，整合環(huán)境組數(shù)據(jù)求取BHK 細胞的有效基元模式[17]。這仍需要先計算所有的基元模式，再進行簡化。應用環(huán)境實驗數(shù)據(jù)在基元模式上進行多變量回歸時，原則上實驗變量數(shù)要高于顯著的基元模式數(shù)，可對于大規(guī)模網(wǎng)絡來說很難實現(xiàn)。

軟件在系統(tǒng)生物學的研究中有著重要的作用，性能良好的軟件需要具有功能豐富、界面友好、計算速度快和方便調(diào)用等特點。目前，CellNetAnalyzer[18]、OptFlux[19]、YANAsquare[20]、EFMtool[7]和Tools-4-Metatool (T4M)[21]等都可以計算基元模式。CellNetAnalyzer 是基于Matlab的圖形界面軟件，可以計算基元模式以及分析相關的代謝網(wǎng)絡拓撲性質(zhì)，同時還可以研究信號傳導網(wǎng)絡。為解析高通量數(shù)據(jù)，CellNetAnalyzer 也開發(fā)了可以獨立于圖形用戶界面的應用程序界面[22]。YANAsquare為Java開發(fā)的圖形界面軟件，調(diào)用Metatool 作為計算基元模式的工具，提出的基元模式活性與酶活的轉(zhuǎn)換關系缺乏理論基礎，在應用中需要注意。YANAsquare 的優(yōu)點是可以實現(xiàn)代謝網(wǎng)絡模型SBML 格式和Metatool 格式的轉(zhuǎn)換，但是計算速度慢，數(shù)據(jù)格式還有待改進。比如，目前化學計量系數(shù)只能為整數(shù)，而很多代謝網(wǎng)絡的生物質(zhì)合成反應系數(shù)并非整數(shù)。T4M 是基于網(wǎng)絡的基元模式分析平臺，既可進行基元模式分析，也可以進行比較，其代謝網(wǎng)絡及基元模式的圖形自動輸出還有待優(yōu)化。還需要注意的是，T4M 的輸入和輸出是Metatool 格式，并非SBML 格式，需要先用YANAsquare 等軟件將SMBL 格式轉(zhuǎn)化為Metatool 文件。EFMtool 在Matlab 中運行，可以計算基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型，但不是圖形界面文件，略顯不便。OptFlux也是用Java 開發(fā)的軟件，可以計算基元模式，然而其他的代謝途徑分析功能不多。COBRA 中也有了計算基元模式的模塊，但是其主要功能還是進行代謝網(wǎng)絡構建與代謝通量分析[23]。

2 基元模式分析的應用

基元模式分析在代謝工程與生物過程工程等領域的應用可以歸納為以下6個方面(圖1)。

2.1 代謝途徑與魯棒性

圖1 基元模式分析的應用Fig.1 Applications of elementary mode analysis.

構建代謝網(wǎng)絡，計算基元模式僅是基元模式分析的第一步。還要通過這些基元模式分析代謝途徑的功能。Klamt 等建立了紫色非硫菌紅螺菌電子傳遞鏈的動態(tài)網(wǎng)絡模型[24]。該模型在穩(wěn)態(tài)下包含9條基元模式，分別對應光合成和呼吸過程中的ATP 合成與可逆電子流動以及延胡索酸還原。一般情況下，三羧酸循環(huán)、糖酵解和糖異生途徑中沒有將乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為葡萄糖的基元模式[25]。如果插入異檸檬酸裂合酶和蘋果酸合酶相關基因，就可以實現(xiàn)脂肪到葡萄糖的合成?；Ｊ娇梢苑治龌蚝铜h(huán)境擾動對微生物的影響。通過基元模式分析發(fā)現(xiàn)，厭氧條件下戊糖磷酸化途徑對克雷伯氏肺炎桿菌以甘油為底物生成1,3-丙二醇有重要影響，而在好氧條件下三羧酸循環(huán)的影響更大；降低氧的消耗速率有利于1,3-丙二醇的合成[26]。Taffs 等將基元模式的概念用于微生物群落中物質(zhì)和能量流動的分析[27]。具體分析了美國黃石公園熱泉中光合細菌、不產(chǎn)氧光合細菌(綠曲撓菌等)和硫還原細菌間在白天和夜晚的相互作用，包括生物質(zhì)合成和能量產(chǎn)生以及固氮效率等。通量平衡分析(Flux balance analysis，F(xiàn)BA)是在選擇特定目標函數(shù)后通過線性規(guī)劃求取通量平衡分布。如果目標函數(shù)是目標代謝物最大產(chǎn)率，F(xiàn)BA 預測得到的目標代謝產(chǎn)物產(chǎn)率往往都偏高，而通過基元模式分析可以解釋植物乳桿菌的實驗室適應性進化[28]。除了應用到細菌和酵母的代謝途徑分析，基元模式分析在微藻生物燃料的分析中也可以發(fā)揮作用[29-30]。小球藻先進行自養(yǎng)固定CO2，再進行異養(yǎng)產(chǎn)油。其中包括Rubisco 途徑的基元模式得到強化，可以解釋為何產(chǎn)油效率的提高[29]。Rugen 等根據(jù)文獻上的目標函數(shù)對代謝通量進行分解，分析了萊茵衣藻光合自養(yǎng)條件下的代謝，結(jié)果表明光輸入在代謝響應中有重要作用[30]。

代謝網(wǎng)絡具有魯棒性(Robustness)或健壯性(Redundancy)。大量的實驗數(shù)據(jù)證明，除個別關鍵基因的敲除會引發(fā)嚴重后果，多數(shù)的單基因敲除操作僅會明顯改變代謝網(wǎng)絡的局部代謝通量分布，而對網(wǎng)絡整體的影響不大。生命體可以通過調(diào)控來降低基因敲除的影響，維持自身的穩(wěn)定。這也是生命體在長期進化發(fā)展中逐步形成的。代謝網(wǎng)絡結(jié)構的復雜性是其魯棒性的基礎之一。代謝網(wǎng)絡的魯棒性可以由網(wǎng)絡結(jié)構及其動力學、基于優(yōu)化的方法和代謝途徑分析等計算[31]。在代謝網(wǎng)絡中，由某底物到某產(chǎn)物的基元模式通常有很多，這就保證其特定的功能不會被輕易地破壞。在特定生理條件下，只有少量基元模式具有顯著活性。多數(shù)基元模式看似冗余，卻有可能在基因和環(huán)境擾動情況下被激活，是生物體維護自身穩(wěn)定的需要。基元模式數(shù)目可以作為標度網(wǎng)絡魯棒性的一個指標，隨著基因[32]或路徑[33]敲除數(shù)目的增加，魯棒性自然降低。最小切割子集也可以表示網(wǎng)絡的冗余性。Haus 等最早開發(fā)的算法是先計算基元模式，再計算最小切割子集，計算步驟多[34]。在新算法中由代謝網(wǎng)絡結(jié)構信息直接計算最小切割子集，耗時大大減少[35]。生物或催化系統(tǒng)的冗余性和穩(wěn)定性聯(lián)系緊密。在一個簡單的自維持系統(tǒng)中，三個基元模式有不同的意義，刪除一個都無法維持系統(tǒng)的穩(wěn)定[36]。

2.2 代謝通量分解

代謝通量可以分解在基元模式上，并表示為基元模式的線性集合。代謝通量分解是代謝網(wǎng)絡分析的一種重要手段，可以由實測的代謝通量分布求取基元模式系數(shù)，從而判斷該實驗條件下的主要基元模式，并分析代謝網(wǎng)絡的復雜行為。根據(jù)熱力學原理，代謝網(wǎng)絡內(nèi)部的循環(huán)對代謝通量沒有貢獻。代謝通量是基元模式的非負線性組合。

如果矩陣Pexp的秩接近基元模式數(shù)，不同目標函數(shù)的計算結(jié)果差別不大；反之，就會得到差別顯著的解，這就需要目標函數(shù)有好的生物學或者物理學意義，才能具有良好的適用性。線性規(guī)劃求取基元模式系數(shù)與FBA 相似，最大生物量作為目標函數(shù)未必適合所有生物及其生理條件。最小范數(shù)和最小基元模式數(shù)并沒有明確的生物意義。最大基元模式數(shù)假設在外界擾動后代謝網(wǎng)絡趨向冗余，但是在非零基元模式數(shù)相同的條件下，沒有確定基元模式系數(shù)如何分配。最大信息熵原理廣泛應用于物理、化學和生態(tài)領域，以及生物信息學中的基因表達與序列分析。應用最大生物量增長、最小范數(shù)和最大信息熵等目標函數(shù)一起比較分析中國倉鼠卵巢癌細胞、大腸桿菌和釀酒酵母的代謝通量分布，最大信息熵原理算法得到最可行的基元模式系數(shù)分布，在酶控通量算法中也可以得到更準確的代謝通量分布[37]?；Ｊ较禂?shù)的優(yōu)化算法[38-40]見表1。除選擇優(yōu)化中合適的目標函數(shù)，添加熱力學信息作為優(yōu)化的附加限制條件，也可以消除不可行的基元模式[40-41]。

熵是系統(tǒng)非均勻性的標度，和系統(tǒng)的變化趨勢相關。Walschin 等率先分析了代謝途徑熱力學，并關聯(lián)了基元模式系數(shù)及其燃燒熵[42]。該文的缺陷之一是無法計算所有胞內(nèi)代謝通量。另外，為得到簡單線性關系，該文用基元模式家族(Family of elementary mode)的概念簡化了代謝網(wǎng)絡，忽略了生物質(zhì)的合成，用化合物理想狀態(tài)燃燒熵計算基元途徑集總反應的熵，未進行生物體系溶液非理想性修正，結(jié)論為大腸桿菌厭氧過程趨向熵最小。之后，該文作者重新進行了分析，認為代謝網(wǎng)絡及其進化趨向最大化學熵[43]。最近，他們又對適應進化后的最大熵變化進行了討論[44-45]。

表1 基元模式系數(shù)優(yōu)化算法Table 1 Optimization algorithms of elementary mode coefficients

本文作者引入最大信息熵(Shannon entropy)優(yōu)化基元模式系數(shù)[37]，與酶控通量算法結(jié)合，成功預測大腸桿菌基因和環(huán)境擾動后的代謝通量分布。在欠定和不確定條件下，通過胞外13C 同位素標記代謝通量數(shù)據(jù)估算雜交瘤細胞、枯草芽胞桿菌和大腸桿菌胞內(nèi)代謝通量分布。與其他目標函數(shù)相比，可以更為可靠和可行的估算胞內(nèi)代謝通量分布[46]。再應用拉格朗日算子來最大化基于熵的目標函數(shù)，分析求解基元模式系數(shù)[47]。用最大熵原理優(yōu)化基元模式系數(shù)闡明了基元模式與代謝通量的關系，基元模式反映了代謝網(wǎng)絡的微觀性質(zhì)，代謝通量反映了代謝網(wǎng)絡的宏觀性質(zhì)，宏觀性質(zhì)是微觀性質(zhì)的加合，而且這種加合服從最大信息熵原理。最大熵原理作為目標函數(shù)優(yōu)化基元模式系數(shù)為基于基元模式的代謝通量預測提供了可靠基礎。信息熵與化學熵的關系有待深入探索。

圖2是用線性規(guī)劃和最大熵原理求得的釀酒酵母代謝網(wǎng)絡的基元模式系數(shù)[37]。圖中顏色表示對應基元模式系數(shù)的絕對偏差。在原文獻中以柱狀圖表示取得的基元模式系數(shù)，而圖2可以反映這些基元模式系數(shù)的差異?？梢钥闯鰞蓚€目標函數(shù)求取的多數(shù)基元模式系數(shù)值很低，因此偏差也小，表現(xiàn)為白色。最大熵原理求得的第31條基元模式的系數(shù)最大，而二次規(guī)劃求得的第28條基元模式的系數(shù)最大，但是這兩個基元模式系數(shù)差別較大，在圖中表現(xiàn)為深色條帶。

2.3 穩(wěn)態(tài)代謝通量分析

圖2 最大熵原理(MEP)和二次規(guī)劃(QP)求取基元模式系數(shù)(釀酒酵母，μ=0.3)Fig.2 Elementary mode coefficients calculated by Maximum Entropy Principle (MEP) and Quadratic Programming(QP) for S.cerevisiae (μ=0.3).

在系統(tǒng)生物學中，有約束代謝通量分析用以考察代謝產(chǎn)物分布以及代謝網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點等。代謝通量可以通過動態(tài)或穩(wěn)態(tài)模型計算。動態(tài)模型需要大量實驗數(shù)據(jù)關聯(lián)動態(tài)模型參數(shù)，一般來說包括的生化反應數(shù)少。代謝控制分析被用于關聯(lián)酶活和代謝通量的關系。代謝控制分析的缺點是需要大量、準確的實驗數(shù)據(jù)或者代謝網(wǎng)絡內(nèi)部所有生化反應的動力學方程。因此，目前局限在簡單代謝途徑或小尺度的代謝網(wǎng)絡分析中。

有約束代謝通量分析是常用的代謝網(wǎng)絡穩(wěn)態(tài)分析方法，特別是FBA。在基因組尺度的代謝網(wǎng)絡分析中，F(xiàn)BA 成功地用于大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽胞桿菌等微生物，中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)和幼鼠腎細胞(BHK)等動物細胞和小球藻等植物細胞的代謝網(wǎng)絡分析。FBA 計算簡單，應用廣泛，問題是必須事先指定目標函數(shù)，再通過線性規(guī)劃求取代謝通量分布。最大生物量增長可以作為目標函數(shù)計算大腸桿菌等微生物的代謝通量分布，并能與實驗數(shù)據(jù)基本符合。但是這個目標函數(shù)不能適用于全部的生命體，以及一些生物體的不同生長階段。比如，人的紅細胞本身就不進行生物質(zhì)合成，無法選擇最大生物量作為目標函數(shù)。微藻在正常培養(yǎng)和氮缺乏條件下的生物質(zhì)中糖、蛋白質(zhì)和脂類等主要組成發(fā)生顯著變化，特別是氮脅迫后生物質(zhì)合成受到抑制。以最大生物量增長為目標函數(shù)顯然不適合確定微藻不同調(diào)控狀態(tài)下其生物質(zhì)內(nèi)糖、蛋白質(zhì)和脂類的具體分配。另外，最大ATP 利用等基于生物學假設的目標函數(shù)的通用性還要考察。

基于基元模式分析的代謝通量算法研究是目前代謝工程領域的新增長點。酶控通量算法(Enzyme control flux)[48]集成酶活數(shù)據(jù)和野生株代謝通量數(shù)據(jù)預測突變體的代謝通量分布。與FBA 不同，不需事先指定目標函數(shù)，可以集成實驗數(shù)據(jù)對代謝網(wǎng)絡進行分析?；蚋淖兺克惴?Genetic modification of flux)[49]聯(lián)系代謝網(wǎng)絡結(jié)構、功能和調(diào)控，對酶活改變后的代謝通量分布進行預測，與實驗報道符合良好。基因改變通量算法的核心是由野生株和突變體的相對基因表達和野生株基元模式系數(shù)預測突變體的基元模式系數(shù)，進而預測突變體的代謝通量分布。該算法可在基元模式水平上定量理解由于基因或環(huán)境擾動造成的代謝或生理狀態(tài)的變化[47]。同時也說明了酶控通量算法是集成酶活數(shù)據(jù)預測代謝通量分布的可行框架。

2.4 動態(tài)模型與生物過程模擬

疫苗和基因重組藥物主要來自于微生物和動物細胞的生物反應器培養(yǎng)。生物過程的動態(tài)模擬是過程分析、檢測和控制的重要工具。生物過程是復雜的，除了受外界環(huán)境因素的影響，生命體本身也具有自我調(diào)節(jié)作用。經(jīng)驗模型往往不能夠反映生物過程的內(nèi)部規(guī)律。目前的檢測技術測定的代謝物有限，在線測定胞內(nèi)代謝物的變化也有困難。隨著基因組技術的完善，對生物代謝過程的了解不斷深入?；Ｊ揭彩巧镞^程建模的手段之一。

除了內(nèi)部循環(huán)，每個基元模式都有一個集總反應來表示該條基元模式從外源底物到外源產(chǎn)物的計量關系。這些集總反應從基因水平描述了生物過程的可能途徑，為建立代謝網(wǎng)絡動態(tài)模型和生物過程模型提供了基礎[50]。建立生物過程模型需要有準確的計量學代謝網(wǎng)絡模型，通過基元模式分析確定外部代謝物構成的集總反應，再經(jīng)過簡化建立宏觀反應模型，最后由實驗數(shù)據(jù)擬合動力學參數(shù)，得到動力學模型。目前，基于基元模式的生物過程動態(tài)模型已成功應用于CHO 細胞[51]、雜交瘤細胞[52]和BHK 細胞[53]等的反應器培養(yǎng)過程，用以生產(chǎn)單克隆抗體或重組融合糖蛋白。目前這些基于基元模式的生物過程模型都是單細胞模型，也未考慮細胞周期的影響。

普度大學Ramkrishna 教授建立了基元模式和控制論變量的混合模型[54-59]。這類模型的特點是通過控制論描述外部代謝物的動態(tài)變化，而由基元模式估算穩(wěn)態(tài)下的胞內(nèi)代謝通量分布。他們首先用包含23個反應的代謝網(wǎng)絡模型分析了大腸桿菌GJT001的厭氧代謝，與通量平衡分析比較可以更好地預測琥珀酸的生產(chǎn)[54]。并預測了大腸桿菌pta-ackA 基因敲除突變株YBS121的厭氧發(fā)酵過程，以及基因擾動對3株表達外源基因的大腸桿菌突變體的影響(表達博伊丁假絲酵母Candida boidinii 的fdh1基因、pta-ackA 敲除同時外源插入枯草芽胞桿菌 alsS 基因，以及adhE-idhA 敲除同時外源插入乳酸乳球菌pyc 基因)，可以與實驗結(jié)果較好吻合，問題是所用的大腸桿菌模型僅有12個反應[55]。由于采用的大腸桿菌模型過于簡單，他們又分析了釀酒酵母在葡萄糖和木糖雙底物條件下的發(fā)酵[56]，與宏觀反應模型(MBMs)和動態(tài)通量平衡分析(dFBA)相比，混合控制論模型(HCM)可更清晰地闡述代謝控制機制。釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡包含38個反應，反應數(shù)增加一般來說基元模式數(shù)也會增加，會造成過參數(shù)化的問題。他們用產(chǎn)率分析算法[14]對基元模式做簡化，降低需要擬合的參數(shù)。之后他們又開發(fā)了集總混合控制論模型(L-HCM)，將經(jīng)典的集總控制論模型和HCM 結(jié)合在一起，從有限的數(shù)據(jù)預測釀酒酵母(代謝網(wǎng)絡模型包含53個反應)的好氧發(fā)酵[57]。進一步修改集總權重的計算方式并將L-HCM 推廣到大腸桿菌(代謝網(wǎng)絡模型包含67個反應)的厭氧生長[58]。最近，該模型又研究了真氧產(chǎn)堿桿菌(代謝網(wǎng)絡模型包含36個反應)合成聚羥基丁脂的情況，認為多穩(wěn)態(tài)在實際中發(fā)生的可能性很小[59]。這類基于基元模式的混合模型在預測代謝行為上有一定的優(yōu)越性，但是和dFBA 相比還無法用到基因組尺度的代謝網(wǎng)絡模型上，主要原因還是基元模式的組合爆炸問題。

2.5 代謝調(diào)控

生物網(wǎng)絡結(jié)構、功能、調(diào)控間存在緊密的聯(lián)系?？刂朴行?Control effective flux)是基于基元模式的算法，僅僅需要代謝網(wǎng)絡結(jié)構信息就可以關聯(lián)環(huán)境條件擾動(如底物由葡萄糖換成乙酸、乳酸或乙醇)后轉(zhuǎn)錄水平的變化[60]。本文作者將控制有效通量算法用于基因擾動，比如大腸桿菌的基因敲除，同樣可以得到較滿意的關聯(lián)結(jié)果[49]。為提高關聯(lián)精度還可以改進算法，如使用更大規(guī)模的代謝網(wǎng)絡、根據(jù)不同的培養(yǎng)條件選擇主要的基元模式等[60]。控制有效通量算法的局限與代謝網(wǎng)絡結(jié)構有關，比如仍無法區(qū)分同工酶。Schuster 等首先否定了代謝網(wǎng)絡向分子產(chǎn)率最大的方向進化[61]。Jens Nielsen 和合作者提出應用基于化學熵的算法選擇釀酒酵母代謝過程中控制通量的關鍵酶[62]。最大化學熵和最大信息熵有相似的形式。信息熵在沒有足夠信息的情況下適用，而化學熵要對含生物體系溶液進行非理想性修正，否則可能會影響預測結(jié)果的準確性。代謝途徑的熵分析已經(jīng)引起很多專家的重視，值得深入研究。

環(huán)境因子對生物的影響也是顯著的。大量研究專注于基因功能和基因-基因相互作用，而基因和環(huán)境的相互作用研究卻不多。這些影響可以從多方面進行考慮。比如，細胞培養(yǎng)過程中存在不同生理狀態(tài)，而這樣的狀態(tài)與培養(yǎng)基中細胞分泌的代謝物濃度等存在一定聯(lián)系。環(huán)境組引導的潛在途徑投影算法(Envirome-guided projection to latent pathways)用基元模式描述細胞功能，關聯(lián)BHK 細胞在不同培養(yǎng)條件的27個動態(tài)環(huán)境數(shù)據(jù)(溫度、pH，滲透壓和24個胞外代謝物濃度)可以獲得在統(tǒng)計學上最顯著的基元模式[63]。而Carlson 探討了每個基元模式的成本效益與大腸桿菌復雜行為的關系[64]。這里的成本效益主要是指生成1摩爾生物質(zhì)消耗的葡萄糖(電子供體)和生成1摩爾生物質(zhì)消耗的氧(電子配體)。Wessely 等組合基元通量趨勢、網(wǎng)絡推斷和動態(tài)優(yōu)化等方法，集成基因組和蛋白質(zhì)組等數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與每條基元模式上的蛋白投資相關并且存在不同的調(diào)控機制[65]。集合基因序列信息和基元模式，萊茵衣藻氮代謝的生理周期代謝調(diào)控機制最近也取得了進展[66]。探索代謝調(diào)控機理，綜合反映基因和環(huán)境擾動對代謝網(wǎng)絡的影響，也可以為菌株和藻株的突變體設計提供參考。

2.6 菌株設計

突變體構建的策略包括敲除副產(chǎn)物的合成基因、構建新的代謝途徑、調(diào)控代謝通量在關鍵節(jié)點的分布等?？梢酝ㄟ^分子生物學手段實現(xiàn)單基因敲除、多基因敲除、基因的過量表達等。以往的研究通常把代謝途徑上的第一個酶作為關鍵或限速步驟，比如過量表達微藻油脂合成中的乙酰輔酶A 羧化酶卻又效果不大?；Ｊ椒治鰹榫旮脑焯峁┝死碚摽蚣?，利用系統(tǒng)生物學原理，從代謝網(wǎng)絡整體出發(fā)，計算基因工程改造與目標代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的關系，尋找基因工程改造的目的基因。已成功應用大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和克雷伯氏肺炎桿菌的改造[67-73]。敲除乳酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶復合體的枯草芽胞桿菌突變體，其異丁醇的產(chǎn)率可以達到理論值的61%，是野生株的2.3倍[68]；大腸桿菌多基因敲除突變體以甘油為底物，每升可產(chǎn)乙醇40 g，是理論值的90%[70]；大腸桿菌多基因敲除突變體的類胡蘿卜素產(chǎn)率是野生株的4倍[71]。這些實例都說明，基元模式菌株設計是有效的(詳見表2)。

基于基元模式分析的菌株設計策略有兩類。一類是先構筑代謝網(wǎng)絡模型，計算基元模式；再對基元模式進行分類，保留能夠進行生物質(zhì)合成同時生產(chǎn)目標產(chǎn)物的基元模式，敲除其他副產(chǎn)物的基元模式。如果代謝網(wǎng)絡模型很大，代謝產(chǎn)物很多，按照這種方法需要敲除的基因過多。而且一般來說，這類策略敲除的是代謝副產(chǎn)物合成基因。另一類就不僅僅關注副產(chǎn)物的合成基因。通過分析每條基元模式的目標產(chǎn)物產(chǎn)率，以提高目標產(chǎn)物整體產(chǎn)率和保證生物質(zhì)合成為目標，在全網(wǎng)絡范圍內(nèi)搜索目的基因。文獻[74]提出了一種基于整數(shù)算法的優(yōu)化策略，敲除目的基因提高大腸桿菌生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)率(5010個基元模式)。Flux Design 通過統(tǒng)計關聯(lián)，尋找目的代謝產(chǎn)物高表達的過量表達或敲除基因，并以谷氨酸棒桿菌(60個反應)和黑曲霉(220個反應)為例分別考察了賴氨酸和酶的生產(chǎn)[75]。CASOP 通過基元模式評價反應重要性來選擇過量表達和敲除的目的基因來提高產(chǎn)率，該文以107個反應的大腸桿菌模型為例考察了琥珀酸的過量生產(chǎn)[76]。Flux Design 和CASOP 僅能提供定性的描述，而本文作者開發(fā)的基因改變通量算法可以定量地描述基因過量表達、部分或完全失活后的代謝通量分布[49]。優(yōu)化菌株設計準則，提高突變體代謝通量的定量預測能力，是下一步要研究的內(nèi)容。建議綜合多個軟件或算法的優(yōu)化結(jié)果選擇改造的候選目的基因。

表2 基元模式分析菌株設計實例Table 2 Examples of Strain Design by EMA

2.7 信號傳導網(wǎng)絡

最初，基元模式和極端途徑主要用于代謝網(wǎng)絡的分析，并且有了廣泛的應用。將代謝網(wǎng)絡的分析方法拓展到基因調(diào)控網(wǎng)絡和信號傳導網(wǎng)絡，也是系統(tǒng)生物學的最新進展。如果用有向圖來描述基因調(diào)控網(wǎng)絡，其節(jié)點是基因，而邊是基因間的相互作用；對信號傳導網(wǎng)絡，節(jié)點是信號分子，而邊是布爾邏輯關系，表達激活或抑制；代謝網(wǎng)絡中的節(jié)點是代謝物，而邊是生化反應。代謝網(wǎng)絡的顯著特點是質(zhì)量平衡，而信號傳導是信息的流動。在CellNetAnzlyzer 中，就可以構建和分析T 細胞的信號傳導網(wǎng)絡[18,22]。信號傳導網(wǎng)絡較代謝網(wǎng)絡復雜，還需要設計新的算法計算信息流分布，并集成信號傳導網(wǎng)絡和代謝網(wǎng)絡系統(tǒng)分析信號傳導與代謝的關系。

3 結(jié)論與展望

基元模式已經(jīng)成為系統(tǒng)生物學研究的重要平臺工具。研究對象從代謝網(wǎng)絡發(fā)展到信號傳導網(wǎng)絡；研究尺度從基因到生物過程以及生態(tài)系統(tǒng)；數(shù)學描述從穩(wěn)態(tài)分解到動態(tài)解析；研究領域從微生物代謝到人類疾病。

基元模式分析的基礎是準確、完備的代謝網(wǎng)絡信息。代謝網(wǎng)絡模型越充實，相對而言可以更準確的描述生命系統(tǒng)，基元模式的組合爆炸問題也會更突出，這也是限制基元模式分析應用的主要因素。通過改進算法可以提高計算速度，但分析這些基元模式仍是困難的。根據(jù)研究體系的需要，選擇適當規(guī)模的代謝網(wǎng)絡模型，或者根據(jù)添加限制條件，選擇最關鍵的基元模式加以分析是較為可行的方法。以基元模式為基礎，結(jié)合組學數(shù)據(jù)和熱力學等限制條件，可以深入理解代謝調(diào)控規(guī)律和構建新的代謝途徑?；诨Ｊ降木暝O計算法取得了一定進展。集成野生株實驗數(shù)據(jù)可以簡化代謝網(wǎng)絡結(jié)構，更有針對性地尋找基因工程改造的目的基因，提高菌株設計效率。相信基元模式分析在生物網(wǎng)絡和途徑分析中將會有更多的應用。

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