結(jié)核桿菌IFN-γ在結(jié)核性腦膜炎鑒別診斷中的應(yīng)用

林正豪 曾劍鋒 劉國(guó)輝

（1 深圳市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518112；2 深圳市第三人民醫(yī)院結(jié)核科，廣東 深圳 518112）

結(jié)核桿菌IFN-γ在結(jié)核性腦膜炎鑒別診斷中的應(yīng)用

林正豪1曾劍鋒2劉國(guó)輝2

（1 深圳市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518112；2 深圳市第三人民醫(yī)院結(jié)核科，廣東 深圳 518112）

目的 探討外周血結(jié)核桿菌抗原特異性 γ 干擾素水平在結(jié)核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎鑒別診斷中的作用。方法 回顧性分析本院13 例菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎、15 菌陰結(jié)核性腦膜炎及 11 例隱球菌性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性 γ 干擾素水平差異。結(jié)果 菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性 γ 干擾素 9 例陽(yáng)性，4 例陰性，陽(yáng)性率 69.2%，菌陰結(jié)核性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性 γ 干擾素 10 例陽(yáng)性，5 例陰性，陽(yáng)性率 66.7%，隱球菌性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性 γ 干擾素 1 例陽(yáng)性，10 例陰性，陽(yáng)性率 0.09%，列聯(lián)表資料的 χ2檢驗(yàn)（χ2=6.78，P=0.001），三組陽(yáng)性率有差別，經(jīng)組間兩兩比較，菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎與菌陰結(jié)核性腦膜炎陽(yáng)性率無顯著性差異（χ2=4.31，P=0.07），菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽(yáng)性率有顯著性差異（χ2=7.37，P=0.013），菌陰結(jié)核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽(yáng)性率有顯著性差異（χ2=8.26，P=0.024）。結(jié)論 外周血結(jié)核桿菌抗原特異性 γ 干擾素檢測(cè)可作為結(jié)核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎早期鑒別診斷的輔助手段。

腦膜炎；結(jié)核；隱球菌；γ干擾素；診斷

結(jié)核性腦膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是肺外結(jié)核重癥，病死率及致殘率均較高，隱球菌性腦膜炎（Cryptococccal neoformans meningitis，CNM）是由新型隱球菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)會(huì)性感染。TBM及CNM患者的臨床經(jīng)過及腦脊液生化改變十分相似，影像學(xué)檢查缺乏特異性，早期病原檢出率低，致使兩者鑒別困難，容易誤診[1]。通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（Elispot）檢測(cè)外周血結(jié)核分枝桿菌抗原特異性γ干擾素（IFN-γ）在診斷結(jié)核菌感染方面具有良好的敏感性及特異性[2]。本文回顧性分析13例菌陽(yáng)TBM患者、15例菌陰TBM患者及11例CNM患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素反應(yīng)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有病例均為我院2011年1月至2012年8月住院患者，菌陽(yáng) TBM組腦脊液抗酸染色或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，菌陰TBM組典型TBM臨床表現(xiàn)、腦脊液改變，腦脊液抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，經(jīng)抗結(jié)核治療效果顯著，CNM組腦脊液墨汁染色發(fā)現(xiàn)隱球菌或腦脊液隱球菌培養(yǎng)陽(yáng)性。三組患者均無其他器官感染結(jié)核桿菌證據(jù)。菌陽(yáng)TBM組13例，男9例，女4例，年齡（27.4±9.1）歲，菌陰TBM組15例，男8例，女7例，年齡（29.4±11.7）歲，CNM組11例，其中男9例，女2例，年齡（25.7±10.1）歲，三組患者性別及年齡分布無明顯差異。

1.2 方法

所有病例均抽取乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血5mL，送實(shí)驗(yàn)室行Elispot檢測(cè)，操作方法參照文獻(xiàn)[3]：采血后2h常規(guī)分離外周淋巴細(xì)胞，在活化后預(yù)包被好抗體的平板中，每孔加入100uL，每孔細(xì)胞濃度為2×105cells。背景陰性對(duì)照空中不加入任何刺激物。陽(yáng)性對(duì)照每孔加入5uL植物血凝素，終極濃度5ug/mL。實(shí)驗(yàn)孔分別加入結(jié)核菌重組蛋白抗原和合成的結(jié)核菌多肽抗原（ESAT-6、PoolA、PoolB），終極濃度均為5ug/mL。然后蓋上板蓋，放入37oC、5%CO2培養(yǎng)箱16～24h。緊跟2次洗板和加入檢測(cè)抗體孵育，最后加入顯色劑顯色。待顯色洗板后，Elispot斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種計(jì)參數(shù)，做統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)結(jié)果根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量設(shè)定，每一個(gè)反應(yīng)孔中斑點(diǎn)數(shù)減去陰性孔中斑點(diǎn)數(shù)為檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果≥30為陽(yáng)性，如果結(jié)核菌重組蛋白抗原（ESAT-6）、合成的結(jié)核菌多肽抗原A （PoolA）和合成的結(jié)核菌多肽抗原B （PoolB）3種抗原中任一種抗原檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果判斷為陽(yáng)性，3種抗原檢測(cè)結(jié)果均為陰性，則結(jié)果判斷為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組陽(yáng)性率比較采用列聯(lián)表資料χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素9例陽(yáng)性，4例陰性，陽(yáng)性率69.2%，菌陰結(jié)核性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素10例陽(yáng)性，5例陰性，陽(yáng)性率66.7%，隱球菌性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素陽(yáng)性率0.09%，經(jīng)列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)（χ2=6.78，P=0.001），三組陽(yáng)性率有差別，組間兩兩比較，菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎與菌陰結(jié)核性腦膜炎陽(yáng)性率無顯著性差異（χ2=4.31，P=0.07），菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽(yáng)性率有顯著性差異（χ2=7.37，P=0.013），菌陰結(jié)核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽(yáng)性率有顯著性差異（χ2=8.26，P=0.024）。見表1。

表1 三組外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

TBM與CNM是由不同病原引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，二者均呈亞急性或慢性病程，主要表現(xiàn)為頭痛、嘔吐、發(fā)熱，顱神經(jīng)損害，腦膜刺激征陽(yáng)性，可引出病理反射，二者的顱內(nèi)壓、腦脊液ADA與氯化物含量等可能存在差異[4]，臨床上卻很難由此將兩者鑒別開來，病原學(xué)檢查仍是重要的鑒別診斷依據(jù)，但病原學(xué)檢查一般比較費(fèi)時(shí)，陽(yáng)性率低，往往不能及時(shí)提供幫助。TBM臨床表現(xiàn)復(fù)雜，癥狀多不典型，早期不易確診[5]。CNM臨床上較少見，腦脊液墨汁染色及培養(yǎng)仍是確診該病的主要手段[6]，患者在腦脊液查及隱球菌之前通常被當(dāng)成TBM，從而延誤治療，而早期診斷治療對(duì)預(yù)后至關(guān)重要[7]。故臨床上迫切需要新的檢測(cè)手段來滿足二者鑒別，Elispot檢測(cè)外周血結(jié)核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ便是近年來發(fā)展較快的新一代檢測(cè)結(jié)核病的免疫學(xué)診斷技術(shù)。

Elispot技術(shù)是IFN-γ釋放試驗(yàn)中的一種，采用的結(jié)核桿菌特異性抗原為ESAT-6和CFP-10，其編碼基因位于RD1區(qū)，RD1在卡介苗和絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的基因組中是缺失的，理論上可以避免結(jié)核菌素試驗(yàn)中影響特異性的PPD交叉抗原，能夠較好地區(qū)分真性結(jié)核感染和卡介苗接種誘導(dǎo)的反應(yīng)。在結(jié)核桿菌特異性抗原刺激下，測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞中能釋放IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)量，從而判斷機(jī)體是否感染結(jié)核[8]，該結(jié)果不受卡介苗接種的影響，與非結(jié)核分枝桿菌無交叉反應(yīng)，對(duì)結(jié)核感染具有良好的診斷價(jià)值[2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)菌陽(yáng)TBM患者、菌陰TBM患者及CNM患者外周血核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ，結(jié)果顯示菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素陽(yáng)性率69.2%，菌陰結(jié)核性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素陽(yáng)性率66.7%，隱球菌性腦膜炎患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素陽(yáng)性率0.09%，三組陽(yáng)性率有差別（χ2=6.78，P=0.001），組間兩兩比較，菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎與菌陰結(jié)核性腦膜炎陽(yáng)性率無顯著性差異（χ2=4.31，P=0.07），菌陽(yáng)結(jié)核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽(yáng)性率有顯著性差異（χ2=7.37，P=0.013），菌陰結(jié)核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽(yáng)性率有顯著性差異（χ2=8.26，P=0.024），菌陽(yáng)及菌陰TBM患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素陽(yáng)性率均較高，CNM患者外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素陽(yáng)性率較低，當(dāng)臨床上鑒別TBM、CNM困難時(shí)，通過Elispot技術(shù)檢測(cè)患者外周血核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ無疑是有益的補(bǔ)充鑒別手段，值得臨床推廣應(yīng)用。

臨床上診斷為TBM的患者經(jīng)治療后，外周血結(jié)核桿菌抗原特異性γ干擾素陽(yáng)性率是否有變化？如有變化，與療效是否相關(guān)？需要進(jìn)一步研究。

當(dāng)其他系統(tǒng)感染結(jié)核、高齡患者、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、免疫缺陷等有可能影響外周血核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，臨床分析結(jié)果時(shí)要綜合考慮上述情況。

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Application of Mycobacterium Tuberculosis IFN-γresponses in Differential Diagnosis of Tuberculous Meningitis

LIN Zheng-hao1, ZENG Jian-feng,2, LIU Guo-hui2
(1 Department of Neurology, Shenzhen Third People’s Hospital , Shenzhen 518112, China; 2 Department of Tuberculosis Division, Shenzhen Third People’s Hospital, Shenzhen 518112, China)

ObjectiveTo discuss clinical application of Mycobacterium tuberculosis antigen specific IFN-γresponses in antidiastole between tuberculous meningitis and cryptococal neoformans meningitis.MethodsIFN-γ responses in peripheral blood of 13 patients with csf positive tuberculous meningitis , 15 patients with csf negative tuberculous meningitis and 11 patients with cryptococal neoformans meningitis were tested and then analyzed retrospectively.ResultsPositive IFN-γ responses were detected in 69.2%(9/13)of patients with csf positive tuberculous meningitis, 66.7%(10/15)of patients with csf negative tuberculous meningitis and 9.0%(1/11) of patients with cryptococal neoformans meningitis. IFN-γ responses in the three groups is statistically different(χ2=6.78,P=0.001). Through the comparison between the two two groups, IFN-γ responses positive rate between csf positive tuberculous meningitis patients and csf negative tuberculous meningitis patients is not statistically different(χ2=4.31,P=0.07). IFN-γ responses positive rate between csf positive tuberculous meningitis patients and cryptococal neoformans meningitis patients is statistically different(χ2=7.37,P=0.013). IFN-γ responses positive rate between csf negative tuberculous meningitis patients and cryptococal neoformans meningitis patients is statistically different(χ2=8.26,P=0.024).ConclusionIFN-γresponses in peripheral blood can be used as an assistant means to discriminate cryptococal neoformans meningitis from tuberculous meningitis.

Meningitis ; Tuberculosis; Neoformans; IFN-γ; Diagnosis

R515.2

：B

：1671-8194（2013）10-0004-02

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201202062）