黃芩根圍AM真菌優(yōu)勢(shì)種
——網(wǎng)狀球囊霉的培養(yǎng)

賀學(xué)禮，王蒙

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

黃芩根圍AM真菌優(yōu)勢(shì)種
——網(wǎng)狀球囊霉的培養(yǎng)

賀學(xué)禮，王蒙

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

為建立網(wǎng)狀球囊霉的最佳培養(yǎng)體系，利用盆栽培養(yǎng)法研究了不同條件對(duì)黃芩根圍AM真菌優(yōu)勢(shì)種——網(wǎng)狀球囊霉（Glomusreticulatum）繁殖的影響.結(jié)果表明，不同宿主植物、基質(zhì)以及接種量對(duì)網(wǎng)狀球囊霉繁殖有顯著影響，在以黑麥草為宿主、基質(zhì)為基質(zhì)Ⅲ、接種量為50／盆時(shí)，孢子密度35.3／g，總定殖率83.9%，泡囊與叢枝定殖率分別為64.8%和4.7%，琥珀酸脫氫酶（SDH）活性顯著高于其他處理.隨接種量增加，SDH活性、孢子密度、定殖率、宿主植物黃酮含量顯著提高.明確了網(wǎng)狀球囊霉的最佳培養(yǎng)體系為：黑麥草為宿主植物，沙、土、草炭、陶粒體積比2∶2∶1∶2為基質(zhì)，孢子接種量50／盆.此外，對(duì)網(wǎng)狀球囊霉與宿主植物生長(zhǎng)的相關(guān)性進(jìn)行分析表明，網(wǎng)狀球囊霉孢子密度、總定殖率與地下干質(zhì)量和黃酮含量、易提取球囊霉素（EEG）、總提取球囊霉素（TEG）正相關(guān)，說(shuō)明AM真菌繁殖直接影響宿主植物生長(zhǎng)，并有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用.

黃芩；網(wǎng)狀球囊霉；中間宿主；培養(yǎng)基質(zhì)；孢子接種量

AM真菌是生物界最廣泛、最重要的一類共生真菌，能夠促進(jìn)植物生根，增強(qiáng)植物抗逆性，調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)代謝活動(dòng)，提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)［1－8］.因其對(duì)植物有諸多有益作用，被譽(yù)為“生物肥料”.目前，對(duì)于AM真菌的研究主要集中在AM真菌對(duì)植物生長(zhǎng)、抗逆性方面［1－8］，而對(duì)如何提高AM真菌繁殖量，國(guó)內(nèi)外研究主要集中在基質(zhì)對(duì)AM真菌繁殖量的影響.劉廣福［5］等研究發(fā)現(xiàn)，草炭土、田間土、河沙體積比為2∶2∶1是摩西球囊霉的優(yōu)良繁殖基質(zhì)；陳寧等［6］以高粱為宿主接種摩西球囊霉，發(fā)現(xiàn)最佳培養(yǎng)基質(zhì)是加入沙與壤土體積比為1∶1；曾瑞香等［8］研究顯示，栽培基質(zhì)為泥炭、珍珠巖、河沙體積比1∶1∶1，侵染率、侵染強(qiáng)度、菌絲長(zhǎng)度最高；Gaur and Adholeya［9］等在基質(zhì)中加入沙、珍珠粉、木炭粉、黏性磚粉，發(fā)現(xiàn)AM真菌繁殖體數(shù)量增加了40%～50%.而有關(guān)宿主植物、基質(zhì)、接種量三者組合對(duì)AM真菌生長(zhǎng)和繁殖的影響研究未見(jiàn)報(bào)道.

黃芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）為唇形科黃芩屬草本植物，藥用其根，具有清熱解毒，燥濕瀉火，止血安胎的功效.目前，由于用藥范圍擴(kuò)大，黃芩野生資源供不應(yīng)求，已變野生為人工栽培.研究表明，AM真菌能與黃芩根系形成良好共生關(guān)系，促進(jìn)黃芩生長(zhǎng)［4，10］.本文通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)，研究了培養(yǎng)基質(zhì)、中間載體和孢子接種量等因素對(duì)黃芩AM真菌優(yōu)勢(shì)種——網(wǎng)狀球囊霉生長(zhǎng)的影響，以便建立網(wǎng)狀球囊霉培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步研制高效菌根制劑和菌根生物技術(shù)應(yīng)用提供依據(jù).目前，關(guān)于網(wǎng)狀球囊霉擴(kuò)繁的研究未見(jiàn)報(bào)道.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 網(wǎng)狀球囊霉

用濕篩法［11］從河北安國(guó)市中藥材種植基地黃芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）根圍土壤中分離網(wǎng)狀球囊霉（Glomusreticulate）孢子作為接種劑.實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)接種量，即10，30，50／盆.

1.1.2 宿主植物

選取三葉草（TrifliumrepensL.）、苜蓿（MedicagosativaL.）和黑麥草（LoliumperenneL.）3種植物為AM真菌中間繁殖載體，種子購(gòu)于河北省保定市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng).

1.1.3 基質(zhì)

選取3種培養(yǎng)基質(zhì)，即基質(zhì)Ⅰ：沙、土體積比為1∶1，基質(zhì)Ⅱ：沙、土、草炭體積比為2∶2∶1，基質(zhì)Ⅲ：沙、土、草炭、陶粒體積比為2∶2∶1∶2.土壤取自安國(guó)中藥材基地黃芩根圍原位土，陶粒、草炭購(gòu)于河北省保定市花鳥魚蟲市場(chǎng).

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

播種前基質(zhì)在121℃下間歇滅菌2次，時(shí)間為1h.實(shí)驗(yàn)器皿（內(nèi)徑7cm×深8.5cm）用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒后使用.播種時(shí)，每盆裝培養(yǎng)基質(zhì)0.75kg.將不同基質(zhì)、接種量、宿主植物進(jìn)行組合，共27個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，共81盆.基質(zhì)裝盆后用水澆透，待表面微干時(shí)播種并接種孢子，出苗10d后定苗，每盆20株，定時(shí)澆水，3個(gè)月后收獲測(cè)定相關(guān)指標(biāo).

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

生物量用稱重法；黃酮含量用超聲波提取法［11］；孢子密度用濕篩法測(cè)定［12］；定殖率用Phillips和Hayman方法測(cè)定［13］；球囊霉素含量用Wright和David方法測(cè)定［14－15］；SDH活性用Smith等方法測(cè)定［16］.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS，SPSS生物統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌生長(zhǎng)狀況

2.1.1 不同處理對(duì)孢子密度的影響

宿主植物為三葉草，基質(zhì)相同，隨接種量增加，孢子密度提高，接種量為50／盆時(shí)孢子密度顯著高于其他接種量.不同基質(zhì)，基質(zhì)Ⅲ的孢子密度顯著高于其他基質(zhì).說(shuō)明不同孢子接種量會(huì)影響網(wǎng)狀球囊霉繁殖量.

宿主植物為黑麥草，基質(zhì)Ⅱ時(shí)，孢子不同接種量間差異不顯著，但在接種量為50／盆時(shí)孢子密度達(dá)最大值；基質(zhì)Ⅰ和基質(zhì)Ⅲ時(shí)，接種量不同孢子密度差異顯著，接種量為50／盆的孢子密度顯著高于其他接種量.接種量為10／盆時(shí)，基質(zhì)Ⅱ的孢子密度顯著高于其他基質(zhì)；接種量為30／盆時(shí)，不同基質(zhì)間孢子密度無(wú)顯著差異；接種量為50／盆時(shí)，基質(zhì)Ⅲ的孢子密度顯著高于其他基質(zhì).

宿主植物為苜蓿，接種量增加孢子密度隨之增加，接種量為50／盆的最高.接種量為10／盆和30／盆時(shí)，不同基質(zhì)間無(wú)顯著差異，在基質(zhì)Ⅲ達(dá)最大值；接種量為50／盆時(shí)，基質(zhì)Ⅲ的孢子密度顯著高于其他基質(zhì).

由表1可知，宿主植物不同，基質(zhì)和接種量相同，黑麥草的孢子密度顯著高于其他宿主植物；接種量為50／盆時(shí)，基質(zhì)Ⅲ的孢子密度最大.

表1 不同處理對(duì)AM真菌生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of AM fungal growth in different treatments

2.1.2 不同處理對(duì)菌絲內(nèi)SDH活性的影響

宿主為三葉草，基質(zhì)Ⅰ時(shí)，不同接種量間SDH活性無(wú)顯著差異；基質(zhì)Ⅱ和基質(zhì)Ⅲ，接種量為50／盆的SDH活性顯著提高.相同接種量，基質(zhì)Ⅲ的SDH活性顯著高于其他基質(zhì).

宿主為黑麥草，接種量為50／盆的SDH活性顯著高于其他接種量.接種量相同，僅基質(zhì)Ⅲ的SDH活性顯著高于基質(zhì)Ⅰ.

宿主為苜蓿，基質(zhì)Ⅰ時(shí)，接種量為50／盆的SDH活性最高；基質(zhì)Ⅱ，接種量為30／盆的SDH活性顯著高于其他處理；基質(zhì)Ⅲ，隨接種量增加，SDH活性提高，在接種量為50／盆時(shí)達(dá)最大值.相同接種量，基質(zhì)Ⅲ的SDH活性高于基質(zhì)Ⅰ和基質(zhì)Ⅱ.

接種量和基質(zhì)相同，黑麥草的SDH活性顯著高于其他植物；接種量為50／盆、基質(zhì)Ⅲ時(shí)，SDH活性最高，顯著高于其他處理（表1）.

2.1.3 不同處理對(duì)AM真菌定殖率的影響

相同宿主，總定殖率均在基質(zhì)Ⅲ、接種量50／盆時(shí)最大，顯著高于其他處理；相同處理下，黑麥草總定殖率顯著高于其他宿主植物，最高達(dá)83.9%.

基質(zhì)Ⅲ、接種量50／盆的泡囊定殖率顯著高于其他處理；基質(zhì)和接種量相同，不同宿主泡囊定殖率存在顯著差異，黑麥草泡囊定殖率顯著高于三葉草和苜蓿.

宿主相同，基質(zhì)和接種量不同，基質(zhì)Ⅲ、接種量50／盆的叢枝定殖率高于其他處理；基質(zhì)相同，叢枝定殖率因接種量不同有所差異，隨接種量增加叢枝定殖率提高.相同基質(zhì)和接種量，苜蓿叢枝定殖率顯著高于其他宿主植物（表1）.

2.1.4 不同處理對(duì)球囊霉素含量的影響

由表1可知，宿主為三葉草，基質(zhì)Ⅲ、接種量為50／盆時(shí)，EEG含量顯著高于其他處理；宿主為黑麥草和苜蓿，基質(zhì)Ⅱ、接種量為50／盆時(shí)，EEG含量顯著高于其他處理.宿主不同，基質(zhì)和接種量相同，三葉草的EEG含量顯著高于其他宿主植物；黑麥草的EEG含量顯著低于其他宿主植物.

以三葉草為宿主的TEG含量顯著高于黑麥草和苜蓿，基質(zhì)Ⅲ、接種量50／盆時(shí)達(dá)最大值，顯著高于其他處理.

2.2 宿主植物生長(zhǎng)狀況

由表2可知，三葉草地下部干質(zhì)量在不同接種量間存在顯著差異；地上部干質(zhì)量，在不同接種量間差異不顯著；基質(zhì)Ⅲ的地下部干質(zhì)量顯著高于基質(zhì)Ⅰ和基質(zhì)Ⅱ.隨接種量增加，地下、地上部黃酮含量提高；不同基質(zhì)相同接種量，地下、地上部黃酮含量在基質(zhì)Ⅲ達(dá)最大值，顯著高于其他基質(zhì).基質(zhì)Ⅲ、接種量為50／盆時(shí)，三葉草地下、地上部黃酮含量均達(dá)最大值.

不同接種量，黑麥草地上、地下部干質(zhì)量差異不顯著；地下部黃酮含量在接種量為30／盆時(shí)，達(dá)最大值；地上部黃酮含量在接種量為50／盆時(shí)達(dá)最大值.相同接種量不同基質(zhì)，基質(zhì)Ⅲ的地上、地下部干質(zhì)量及地上部黃酮含量顯著高于其他基質(zhì)；地下部黃酮含量在基質(zhì)Ⅱ最高.黑麥草地下部干質(zhì)量在基質(zhì)Ⅲ、接種量為30／盆時(shí)達(dá)最大值；地上部干質(zhì)量、黃酮含量在基質(zhì)Ⅲ、接種量為50／盆時(shí)達(dá)最大值；地下部黃酮含量在基質(zhì)Ⅱ、接種量為30／盆時(shí)達(dá)最大值.

相同基質(zhì)不同接種量，苜蓿地上、地下部干質(zhì)量差異不顯著；地上部黃酮含量在接種量為50／盆時(shí)達(dá)最大值.相同接種量不同基質(zhì)，苜蓿地上、地下部干質(zhì)量及黃酮含量差異顯著.苜蓿地下部干質(zhì)量在基質(zhì)Ⅲ、接種量10／盆時(shí)達(dá)最大值；地上部干質(zhì)量、黃酮含量在基質(zhì)Ⅲ、接種量50／盆時(shí)達(dá)最大值；基質(zhì)Ⅱ、接種量30／盆時(shí)，其地下部黃酮含量顯著高于其他處理.?

表2 不同處理?xiàng)l件下宿主植物生長(zhǎng)狀況Tab.2 Growth condition of host plants in different treatments

2.3 AM真菌與宿主植物生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性分析

由表3可知，孢子密度與地下黃酮含量極顯著正相關(guān)，與地下干質(zhì)量、TEG和EEG顯著正相關(guān)；泡囊定殖率與地下干質(zhì)量極顯著正相關(guān)，與孢子密度顯著相關(guān)；叢枝定殖率與孢子密度極顯著相關(guān)，與地下干質(zhì)量和黃酮含量、TEG和EEG顯著相關(guān)；總定殖率與地下干質(zhì)量、孢子密度極顯著相關(guān)，與地下黃酮含量顯著相關(guān).

表3 AM真菌與三葉草的相關(guān)性Tab.3 Relativity analyses between AM fungi and Triflium repens

由表4可見(jiàn)，孢子密度與地上和地下干質(zhì)量、地下黃酮、EEG、TEG正相關(guān)，與地上黃酮含量負(fù)相關(guān)；總定殖率與地上黃酮含量、TEG負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)正相關(guān)；泡囊定殖率與孢子密度顯著正相關(guān)，與地上黃酮負(fù)相關(guān)；叢枝定殖率與孢子密度顯著正相關(guān)，與地上黃酮含量負(fù)相關(guān).

表4 AM真菌與黑麥草的相關(guān)性Tab.4 Relativity analyses between AM fungi and Lolium perenne

由表5可知，孢子密度與地上干質(zhì)量和黃酮含量負(fù)相關(guān)，與地下干質(zhì)量和黃酮含量，EEG，TEG正相關(guān)；總定殖率與地上黃酮含量負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)正相關(guān)；泡囊定殖率與EEG，TEG顯著負(fù)相關(guān)，與孢子密度正相關(guān)；叢枝定殖率與孢子密度顯著正相關(guān)，與地上黃酮負(fù)相關(guān).

表5 AM真菌與苜蓿的相關(guān)性Tab.5 Relativity analyses between AM fungi and Medicago sativa

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種宿主植物均能與網(wǎng)狀球囊霉形成良好共生關(guān)系.相同基質(zhì)及接種量，黑麥草最高定殖率達(dá)83.9%，苜蓿為65.1%，三葉草為55.6%；黑麥草孢子密度最高為35.3／g，苜蓿次之，三葉草最低；黑麥草琥珀酸脫氫酶活性顯著高于其他宿主植物，達(dá)65.3%.說(shuō)明網(wǎng)狀球囊霉繁殖的最佳宿主植物為黑麥草.

網(wǎng)狀球囊霉孢子密度高的處理，植物生物量相對(duì)較高.宿主地下生物量及黃酮含量與孢子密度、泡囊定殖率、叢枝定殖率和總定殖率正相關(guān)，即根部發(fā)達(dá)的處理，孢子密度、定殖率高.說(shuō)明AM真菌在一定程度上可以促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)［1－8］.黑麥草的孢子密度與地上黃酮含量負(fù)相關(guān)，苜蓿的孢子密度與地上干質(zhì)量及黃酮含量負(fù)相關(guān)，說(shuō)明網(wǎng)狀球囊霉并沒(méi)有提高黑麥草和苜蓿地上生物量.黑麥草的球囊霉素含量低于其他宿主植物.說(shuō)明AM真菌產(chǎn)生球囊霉不僅與孢子密度有關(guān)，還受到宿主植物的影響.球囊霉素是由AM真菌產(chǎn)生的一種含金屬離子的糖蛋白，對(duì)維護(hù)AM真菌本身的生物及生理功能極為重要［4，10］，可以間接反映孢子生活狀態(tài)及繁殖情況.本實(shí)驗(yàn)中，三葉草更有利于網(wǎng)狀球囊霉產(chǎn)生球囊霉素.

研究表明，培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)網(wǎng)狀球囊霉孢子繁殖量、菌絲量、定殖率均有影響.Gaur and Adholeya［9］研究發(fā)現(xiàn)，在基質(zhì)中加入沙、珍珠粉、木炭粉、黏性磚粉等，AM真菌繁殖體數(shù)量增加了40%～50%；陳寧等［7］發(fā)現(xiàn)，以高粱為宿主接種摩西球囊霉，最佳培養(yǎng)基質(zhì)是加入沙的量與壤土體積比為1∶1.本實(shí)驗(yàn)選取的3種基質(zhì)中，最佳培養(yǎng)基質(zhì)為沙、壤土、草炭、陶粒體積比2∶2∶1∶2的基質(zhì).相同接種水平及宿主植物，基質(zhì)Ⅲ孢子密度、叢枝、泡囊及總定殖率最高，SDH活性顯著高于其他基質(zhì)，說(shuō)明基質(zhì)Ⅲ適合于網(wǎng)狀球囊霉繁殖和培養(yǎng).基質(zhì)Ⅱ的孢子密度及定殖率顯著低于基質(zhì)Ⅲ，但基質(zhì)Ⅱ的TEG含量和EEG含量顯著高于基質(zhì)Ⅲ.說(shuō)明不同基質(zhì)對(duì)AM真菌產(chǎn)生球囊霉素有影響.

本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有采用接種劑，而是將網(wǎng)狀球囊霉孢子直接接種到基質(zhì)中，從而達(dá)到擴(kuò)繁的目的.目前，對(duì)于這一研究未見(jiàn)報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)中，隨接種量增加，孢子密度、定殖率顯著提高，接種量為50／盆的孢子密度最高，達(dá)35.3／g；孢子密度高的處理，相對(duì)應(yīng)的定殖率和SDH活性也顯著高于其他處理；相同宿主植物，球囊霉素含量在接種量為50／盆時(shí)達(dá)最大值.說(shuō)明孢子接種量為50／盆是最佳水平.本實(shí)驗(yàn)只選取了10，30，50／盆3個(gè)接種量，繼續(xù)增加孢子接種量，孢子密度和定殖率是否會(huì)增加，還需進(jìn)一步研究.

由相關(guān)性分析可知，球囊霉素含量與孢子密度正相關(guān)，即球囊霉素與AM真菌生長(zhǎng)密切相關(guān)［4，8，10］.黑麥草的總定殖率與球囊霉素含量負(fù)相關(guān)，原因可能是AM真菌繁殖會(huì)經(jīng)過(guò)不同階段，當(dāng)處于菌絲侵染階段，其孢子分泌的球囊霉素量會(huì)相對(duì)減少.

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，安國(guó)黃芩AM真菌優(yōu)勢(shì)種——網(wǎng)狀球囊霉擴(kuò)繁的最佳宿主植物為黑麥草，最佳培養(yǎng)基質(zhì)是沙、壤土、草炭、陶粒體積比為2∶2∶1∶2，最適孢子接種量為50／盆.

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（責(zé)任編輯：趙藏賞）

Culture of Glomus reticulatumin the rhizospereo of Scutellaria baicalensis

HE Xueli，WANG Meng
（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

Effects of different conditions on the growth ofG.reticulatumwas studied in pot culture in the experiment.The purpose was to establish the optimal culture system ofG.reticulatum.The results showed that there was appreciable impact in different host plants，culture substrates and inoculum concentrations.When the treatment wasLoliumperenneas host plant，culture substrateⅢand 50inoculum concentrations，the spore density was 35.3spores per gram of soil，the total colonization was 83.9%，vesicular colonization was 64.8%，arbuscular colonization was 4.7%，the activity of SDH was appreciable different with others.With the increasing of inoculum concentration，there was significant improvement among the activity of SDH，spore density，colonization and content of Flavonoids.The activity of SDH，spore density，colonization and content of Flavonoids and the growth of host plant was the highest in culture substrateⅢ.Both spore density and colonization ofG.reticulatumshowed a positive correlation with the dry height of root，content of Flavonoids，EEG and TEG.This claimed that the growth of plants was directly impacted by AM fungi，and the function of AM fungi was to promote the growth of plants.Theoptimal culture system wasL.perenneas host plant，culture substrateⅢ（sand）∶（soil）∶（turf）∶（ceramsite）＝（2∶2∶1∶2）and 50inoculum concentrations.

Scutellariabaicalensis；Glomusreticulate；host plant；culture substrate；inoculum con－centration

Q939.96；Q948

A

1000－1565（2013）03－0280－07

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.03.011

2012－06－16

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2010000273）

賀學(xué)禮（1963－），男，陜西蒲城人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事藥用植物及菌根生物技術(shù)研究.

E－mail：xuelh1256＠yahoo.com.cn