NOTCH1基因3'-UTR段雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建及其活性鑒定

邵新宏 韓 淵 于 游 張才全 (新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院普外科，烏魯木齊 8300002)

目前研究結(jié)果顯示:NOTCH1過度表達或突變表達是結(jié)直腸癌(Colorectal cancers，CRC)和T細胞淋巴瘤 (T cell lymphoblastic leukemia，T－ALL)患者中常見的一種基因異常，常與此類疾病的不良預后有密切關系［1，2］。NOTCH1是 NOTCH 基因編碼的蛋白家族成員之一，它是一種單跨膜受體蛋白，其組成為:胞外區(qū)包括29～36個表皮生長因子樣重復序列和3個富含半胱氨酸(lin12/notch repeat)的Notch重復區(qū);胞內(nèi)區(qū)(Intracellular domain of notch，ICN)由細胞膜向內(nèi)依次是RAM結(jié)構(gòu)區(qū)、6個細胞分裂周期基因10重復區(qū)、2個核定位信號、谷氨酸胺豐富區(qū)和富含PEST序列(即富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的區(qū)域，與Notch受體的穩(wěn)定性有關)，并且NOTCH1在腫瘤細胞的分化、增殖和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。在某些惡性腫瘤中，NOTCH1蛋白的高表達和某些miRNA的異常表達常常共同存在，這說明某些miRNA可能通過調(diào)節(jié)NOTCH1蛋白的表達從而引起腫瘤的發(fā)生。

miRNA是含18～24堿基的短鏈非編碼RNA，通過與靶基因的3'端非編碼區(qū)完全或不完全互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白質(zhì)翻譯或降解靶mRNA，從而調(diào)控目標基因的表達。目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):miRNA在調(diào)節(jié)生物發(fā)育，細胞分化，增殖和凋亡等生物過程中均扮演了重要的角色，并且發(fā)現(xiàn)大約50%的miRNA主要定位于與腫瘤相關的基因組的脆性位點［3］，這些均說明miRNA在腫瘤發(fā)生過程中可能起了至關重要的作用［4－6］。因此，miRNA 與腫瘤的關系已逐漸成為近年來的研究熱點。為了研究NOTCH1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)節(jié)機制，我們使用一種改良的雙熒光素酶報告質(zhì)粒以更加準確評價miRNA靶向調(diào)控基因的熒光素酶的活性。我們成功構(gòu)建了含NOTCH1基因3'非編碼區(qū)(3'untranslated region，3'－UTR)雙熒光素酶報告載體，預測出負性調(diào)控NOTCH1基因表達的miRNA，并證明了 miRNA－34a能夠負性調(diào)節(jié) NOTCH1的表達。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和儀器 人胚腎上皮細胞系293T細胞為本實驗室保存;質(zhì)粒 pmir－RB－REPORTTM(廣州銳博公司產(chǎn)品);hsa－miR－34a inhibitor、hsa－miR－34a inhibitor control均購自江蘇百奧公司;雙熒光素酶檢測試劑盒(Dual－Luciferase Reporter Assay System)為Genecopoeia公司產(chǎn)品、T4 DNA連接酶、DNA提取試劑盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)均購自天根生化科技有限公司;限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI、LA－Taq DNA 聚合酶、dNTP 購自 TaKaRa公司;PCR產(chǎn)物回收試劑盒(QIA quick GelExtraction Kit)、質(zhì)粒提取試劑盒(E．Z．N．A Plasmid Mini Kit)購自OMEGA公司;lipofectamine2000購自Invitrogen公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司;PCR引物合成由廣州銳博公司合成;測序由北京六合華大基因科技股份公司完成;熒光檢測儀為Promega公司產(chǎn)品;感受態(tài)(DH5α)購自北京鼎國生物科技有限公司。

1．2 雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建 從Entrez核酸數(shù)據(jù)庫調(diào)取 NOTCH1基因3'－UTR段的堿基序列(NM－017617)，采用 Primer Premier 5．0軟件設計PCR引物，引物合成由廣州銳博生物公司。引物序列 如 下:NOTCH1－F1648:5'CCG CTCGAG ACGGCGCGCCCCACGAGA 3';NOTCH1－R1648:5'GAAT GCGGCCGC TCACCATCAGTATCATTTTTATTGCAA ATC 3'加黑體分別為XhoⅠ，NotⅠ酶切位點序列，之前序列為保護堿基，引物擴增長度為1 648 bp。以HEK293T細胞基因組DNA為模板行PCR擴增，反應為30μl體系:5×PrimeSTAR Buffer 6μl;2．5 mmol/L dNTPmix 2μl;上下游引物(10 mmol/L)各1 μl;PrimeSTAR HSDNA 聚合酶(2．5 U/μl)0．3 μl，DNA模板 1μl(約100 ng);用滅菌水補足30μl。反應條件為(降落PCR):95℃預變性5分鐘，98℃變性10秒，從65℃每個循環(huán)降1℃退火，72℃延伸100秒，共10個循環(huán);在55℃退火，進行18個循環(huán);72℃繼續(xù)延伸7分鐘，然后4℃ 保存。PCR反應完取2μl產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳分析。按照凝膠純化試劑盒說明書進行純化產(chǎn)物后，用Xhol、NotI對上述PCR產(chǎn)物和載體進行雙酶切后，采用T4 DNA連接酶將線性化改良的雙熒光素酶報告載體(pmir－RB－REPORTTM)與 NOTCH1 基因 3'－UTR 片段相連。反應體系是PCR產(chǎn)物與熒光素酶報告載體以3∶1比例混合。取連接反應產(chǎn)物100μl加入轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，用PstI和EcoR I雙酶切后用瓊脂糖凝膠驗證正確后，再將重組雙熒光素酶報告載體送測序鑒定，此項工作北京六合華大基因科技股份有限公司完成。測序鑒定正確的重組載體命名為pmir－RBREPORTTM－NOTCH1－3'－UTR。

1．3 靶向NOTCH1基因3'－UTR的 miRNA 預測將NOTCH1作為檢索詞，放入在線Target Scan 5．1軟件(http://www．targetscan．org)的檢索框中進行檢索，搜索可能與NOTCH1基因3'－UTR相互作用的miRNA。遵循生物信息學預測的規(guī)則，找出與NOTCH1基因的3'UTR不完全配對的miRNA。即在miRNA的第2位堿基以后，與其靶基因的種子序列成完全配對或不完全配對;并且比較其結(jié)合的自由能及在多物種是否有保守性。

1．4 細胞瞬時轉(zhuǎn)染 HEK293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)、傳代。細胞瞬時轉(zhuǎn)染采用Invitrogen公司的lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，具有操作方法遵循說明書進行。將HEK293T細胞以每孔4×104個接種于96孔培養(yǎng)板中，第二天，按實驗分組將25 ul不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)液與空質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒(0．2 μg)和 miR－34a inhibitor或 control inhibitor(20 umol/L)0．25μl加入EP管中混合5分鐘;同法將lipofectamine2000 0．25 μl與 25 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基加入EP管中混合5分鐘。然后將每組的質(zhì)粒混合液與轉(zhuǎn)染試劑混合液加入到EP管中，再次混合25分鐘后加入96孔培養(yǎng)板中，混合均勻后，放入到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后換用含10%血清的培養(yǎng)基。具體實驗分組如下;①轉(zhuǎn)染pmiR－RBREPORTTM;②共轉(zhuǎn)染 pmiR－RB－REPORTTM及 control inhibitor;③共轉(zhuǎn)染 pmiR－RB－REPORTTM及 miR－34a inhibitor;④ 轉(zhuǎn) 染 pmiR－RB－REPORTTM－NOTCH1－3'－UTR 組;⑤共轉(zhuǎn)染 pmiR－RB－REPORTTM－NOTCH1－3'－UTR 及 control inhibitor組;⑥共轉(zhuǎn)染 pmiR－RB－REPORTTM－NOTCH1－3'－UTR 及 miR－34a inbibitor 組。轉(zhuǎn)染24小時后收集細胞，檢測熒光素酶活性。上述實驗每組設3個平行孔，每組實驗重復3次。

1．5 熒光素酶活性測定 按照Genecopoeia公司的雙熒光素酶檢測試劑盒提供的操作方法檢測在HEK293T 細胞中 miR－34a 對 NOTCH1－3'－UTR 的熒光素酶活性的改變。用只含PBS的孔將熒光檢測儀校準，吸去96孔板中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞后向每孔加入100μl的 Working Solution I，在避光均勻搖動10分鐘，用Promega公司的Glomax 20/20 luminometer熒光檢測儀檢測。測量螢火蟲熒光素酶活性(Rn)，再加入100μl的 Working SolutionⅡ，測量海腎素熒光素酶活性(Ff)。以螢火蟲熒光素酶活性/海腎素熒光素酶活性的值作為熒光素酶活性。以只轉(zhuǎn)染pmiR－RB－REPORTTM載體(空載體)的HEK293T細胞作為對照，并將該組的熒光素酶活性值進行歸一化，其他各組的熒光素酶活性為其相對值。

2 結(jié)果

2．1 NOTCH1基因3'－UTR雙熒光素酶報告載體成功構(gòu)建 我們使用PCR方法擴增得到了NOTCH1基因3'－UTR序列(圖1)，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定其長度為1 648 bp，這與核酸數(shù)據(jù)庫中提供的長度一致。將該片段經(jīng)PstI/EcoR I雙酶切后插入線性化的pmir－RB－REPORTTM載體，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)。隨機挑取克隆擴增后提取質(zhì)粒DNA，再用PstI和EcoRI雙酶切鑒定，證實酶切后得到的1 648 bp的NOTCH1基因3'－UTR片段與預期大小相符(圖2)。并將重組載體送北京六合華大基因科技股份公司進行測序，正向及反向測序圖顯示重組載體中的NOTCH1基因3'－UTR序列與PCR產(chǎn)物長度完全一致，也與GeneBank數(shù)據(jù)庫上的所提供的NOTCH1基因的CDS序列相同，故將該報告重組載體命名為pmiRRB－REPORTTM－NOTCH1－3'－UTR。

2．2 生物學信息學預測結(jié)果 我們得到的預測結(jié)果顯示:has－miR－449a、has－miR－449b、has－miR－34a、has－miR－34c－5p 均與 NOTCH1 基因 3'－UTR 存在互補結(jié)合位點。其中miR－34a從第二位堿基開始與NOTCH1基因的3'－UTR相互配對(圖3);且兩者結(jié)合的自由能為－22．1 kcal/mol;并且保守序列即“種子序列”在人、大鼠、小鼠、犬等物種有嚴格的保守性。這些均符合生物信息學預測靶基因的規(guī)則。

圖1 NOTCH1基因3'非編碼區(qū)聚合酶鏈擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果Fig．1 3'-UTR of NOTCH1 was amp lificated by PCR which was vertified by gel

圖2 為重組載體經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳結(jié)果Fig．2 The recombinant vector was digested by enzymes

圖3 m iR-34a與預測的NOTCH1 3'UTR結(jié)合位點的互補情況Fig．3 Comparison of base pairs between maturem iR-34a and Notch1 3'UTR bs

表1 各實驗組中HEK293T細胞中熒光素酶表達的相對值Tab．1 Relative expression level of Luciferase activity of HEK 293T cells

圖4 HEK 293T細胞中m iR-34a inhibitor對熒光素酶表達的影響Fig．4 Luciferase activity of various reporters in the presence or absence of m iR-34a inhibitor in HEK293T cells

2．3 miRNA對 NOTCH1基因的3'－UTR 調(diào)控 為從以上預測的miRNA結(jié)果中篩選出可能對NOTCH1基因3'－UTR有調(diào)控作用的miRNA。所有的數(shù)據(jù)均以±s表示，具體見表1。以熒光素酶結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染 pmiR－RB－REPORT－NOTCH1－3'－UTR及micro－34a inhibitor的HEK293T細胞組熒光素酶值是只轉(zhuǎn)染 pmiR－RB－REPORTTM的 HEK293T 細胞組熒光素酶值的145%;兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義(F=23．15，P ＜0．01)，其余四組與 pmiR－RBREPORTTM的HEK293T細胞組之間的差異沒有統(tǒng)計學意義(圖4)。

3 討論

1991年，NOTCH1在人類T淋巴母細胞白血病中首先被鑒定出來，提示了NOTCH信號通路與腫瘤發(fā)生有密切相關［7］。目前在脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)了4個 NOTCH 同 源 體:即 NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4。其中NOTCH1不僅對正常細胞分化有重要作用，而且對一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生物 學 過 程 也 起 調(diào) 控 作 用［8，9］。 目 前 研 究 顯 示NOTCH1有生物兩面性:既可以作為癌基因起作用，又可以作為腫瘤抑制因子存在;NOTCH1在生物過程中具有生物種屬特異性及時間特異性。臨床研究表明結(jié)腸癌中NOTCH1的異常激活，則發(fā)揮著癌基因的作用;同時參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展;通過抑制Notch1的表達可以起到化療增敏、治療腫瘤的作用［10］。在T淋巴母細胞白血病及神經(jīng)母細胞瘤中NOTCH1也表現(xiàn)為過度表達，并與這兩種疾病的預后不良有密切聯(lián)系［11］。同時NOTCH1的變異可以導致動脈瓣膜疾?。?2］。但NOTCH1在某些疾病則作為抑癌基因發(fā)揮重要的生物學功能，如宮頸癌，小細胞肺癌等［13，14］。總之，NOTCH1 異常表達均可導致下游信號持續(xù)激活，與患者預后有密切的聯(lián)系。為了進一步研究NOTCH1在結(jié)腸癌的發(fā)生，發(fā)展中的作用及調(diào)節(jié)機制，我們首先構(gòu)建含NOTCH1基因3'端非編碼區(qū)的雙熒光素酶報告質(zhì)粒。

到目前為止，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)了近千個miRNA，其中絕大多數(shù)的生物學功能尚不完全清楚。目前研究表明:1個miRNA能夠靶向多個mRNA，而多個miRNA也可作用于同1個mRNA［15］;而且miRNA之間也可以相互作用調(diào)節(jié)。這些資料說明miRNA很可能作為一個調(diào)控網(wǎng)絡中一份子發(fā)揮重要的生物學作用。不斷積累的證據(jù)顯示:miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關，有些miRNA的異常表達已被證實參與結(jié)直腸癌的發(fā)生與進展，如miR－143、miR－145的表達下調(diào)、miR－21的表達上調(diào)均與結(jié)直腸癌發(fā)生有密切關聯(lián)［16－18］。如果能夠篩選到參與調(diào)控NOTCH1表達的miRNA，并分析其在結(jié)直腸癌中的表達變化及其調(diào)控機制，我們就可以明確這些miRNA在生理和病理狀態(tài)下參與結(jié)直腸癌發(fā)生和進展中所扮演的角色，從而無論是在明確結(jié)直腸癌的發(fā)病機理還是在開發(fā)潛在的治療藥物中都有重要價值。

目前判定miRNA是否與靶基因的3'－UTR結(jié)合主要通過雙熒光素酶檢測和免疫印跡兩種方法聯(lián)合運用［19－21］。本研究是將目的基因的3非編碼區(qū)片段構(gòu)建在經(jīng)過改造的雙熒光素酶報告載體上，即將海腎素熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因構(gòu)建在同一個載體上。這樣就能明顯減少了因微量加樣及載體本身誤差而引起的實驗不準確［22，23］，這是本研究為提高結(jié)果的準確性及可靠性所采取的改進措施。

在軟件預測的基礎上，我們?nèi)孕枰ㄟ^實驗的方法來驗證生物信息學預測的是否準確［24］。我們利用miR－34a抑制劑及對照來驗證miR－34a是否與NOTCH1基因的3'－UTR段結(jié)合從而對熒光素酶活性的有無影響。結(jié)果表明:miR－34a抑制劑對NOTCH1基因3'－UTR熒光素酶報告載體的活性有增強作用，這一作用很可能是由于 miRNA－34a與NOTCH1基因3'－UTR的作用而產(chǎn)生，當然這還有待于進一步檢測miRNA－34a對其結(jié)合位點突變的NOTCH1基因3'－UTR熒光素酶報告載體活性的影響以及對NOTCH1蛋白水平的調(diào)控加以最終驗證。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建的NOTCH1基因3'－UTR的熒光素酶報告載體，同時初步證明NOTCH1的3'－UTR 與 miR－34a有結(jié)合位點，為進一步發(fā)掘調(diào)控NOTCH1基因表達的miRNA提供了實驗基礎。

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