IL-17、IL-6和TGF-β在子宮內膜異位癥患者組織的表達

馮春蝶 王福玲 袁 芳 林 偉 (青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科，青島 266003)

子宮內膜異位癥(EMs)為婦產科常見的良性疾病，但具有類似惡性腫瘤遠處轉移及種植生長的能力。針對EMs的發(fā)病機制有多種學說，具體發(fā)病機制不清，其明確診斷及治療尤其是Ⅰ、Ⅱ期患者的明確診斷一直困擾著臨床醫(yī)師。目前Sampson的子宮內膜種植學說是被大眾認可的主要學說之一。該學說不能解釋為何將近76%～90%的婦女存在經(jīng)血逆流，只有10%～15%左右的婦女發(fā)生子宮內膜異位癥［1］。隨著研究的深入，人們逐漸認識到細胞因子及免疫因素在子宮內膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中的重要作用［2］。本實驗通過檢測 IL-17、IL-6 和 TGF-β在EMs患者異位內膜及在位內膜組織的表達，探討其與EMs發(fā)生、發(fā)展的關系，以期為臨床治療內異癥提供思路。

1 對象與方法

1．1 對象 選擇2011年9月至2012年3月青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科因卵巢巧克力囊腫行腹腔鏡手術治療患者的異位內膜，根據(jù)修正的美國生育協(xié)會(r-AFS)提出的 EMs分期法，所有患者均為Ⅲ～Ⅳ期。平均年齡(28±3)歲。腹腔鏡術中留取卵巢巧克力囊腫的囊壁約1 cm×1 cm，其中有20例患者因不孕同時行宮腔鏡檢查術，取其在位內膜，平均年齡(30±5)歲;同時取因婦科良性疾病在門診行宮腔鏡檢查術患者的正常子宮內膜15例作為正常對照，平均年齡(30±3)歲。組織標本立即放－80℃冰箱保存待測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1．2 入選標準 ①留取異位內膜的患者術后病理均證實為EMs。②同期行宮腔鏡檢查術的患者術后病理證實為良性子宮內膜。③無內外科合并癥，近6個月未使用過激素治療。

1．3 試劑與方法 兔抗人 anti-IL-17，anti-IL-6，anti-TGF-β均購自北京博奧森生物技術有限公司。DAB顯色劑，北京中山生物技術有限公司。采用Elivision免疫組化法檢測組織中IL-17、IL-6及TGF-β的表達，操作步驟嚴格按說明書進行，DAB顯色，蘇木精復染。

1．4 結果判斷 IL-17、IL-6和TGF-β陽性顆粒主要出現(xiàn)在間質浸潤的淋巴細胞中，定位在細胞漿，染色為棕黃色或棕褐色，每張切片隨機選取5個有代表性的視野，每組有5張切片。根據(jù)染色強度及染色面積進行劃分:無染色:0分;淺黃色:1分;棕黃色:2分;棕褐色:3分。根據(jù)染色面積劃分:無染色:0分;＜30%:1分;30% ～60%:2分;＞60%:3分。0分陰性，1分弱陽性，2～4分陽性，5～6分強陽性。陰性及弱陽性視為陰性，陽性及強陽性視為陽性進行組間比較。

1．5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17．0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用卡方檢驗(χ2)，組間相關性檢驗采用Pearson相關分析，所有檢驗結果為P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 IL-17陽性顆粒主要定位在間質浸潤的淋巴細胞的細胞漿，呈散在分布，在異位內膜主要呈強陽性表達(見圖1A)，在35例中強陽性表達占25例，在異位內膜的總體陽性率85．7%，明顯高于在位內膜的 20．0%(P ＜0．01)和對照組的 6．7%(P ＜0.01)，IL-17在在位內膜的表達高于正常內膜，其差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

圖1 IL-17、IL-6和TGF-β在異位內膜、在位內膜和正常內膜表達的典型代表圖(免疫組化染色，×200)Fig．1 H＆E staining and the expressions of IL-17，IL-6 and TGF-β in ectopic endometrium tissues，eutopic endometrium tissues and normal endometrium tissues，typical representative figures(HE，×200)

表1 IL-17、IL-6和TGF-β在子宮內膜組織的表達、例數(shù)分布及陽性率Tab．1 Expressions of IL-17，IL-6 and TGF-β in endometrium tissues，distribution and positive ratio

2．2 IL-6在異位內膜表達強陽性例數(shù)為15例，總體陽性率60%，明顯高于正常內膜的13．3%(P＜0．01)，在位內膜表達的陽性率為40%，與其余兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表1。

2．3 TGF-β在異位內膜表達強陽性例數(shù)為29例，總體陽性率為97．1%，明顯高于在位內膜的20．0%(P ＜0．01)和正常內膜的13．3%(P ＜0．01)，TGF-β在在位內膜的表達高于正常內膜，但其差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表1。

2．4 三者在對照組均無強陽性表達。IL-17在異位內膜的表達與IL-6和 TGF-β呈正相關(r=0．91、0.97，P ＜0．01)。

3 討論

子宮內膜異位癥(EMs)是指具有生長功能的子宮內膜組織出現(xiàn)在子宮腔及宮體肌層以外的其它部位，是一種常見的慢性婦科疾病，主要臨床表現(xiàn)有慢性盆腔痛、不孕等，發(fā)病率近年有增高趨勢，是導致不孕最主要的原因之一。發(fā)病機制較為復雜，目前Sampson的子宮內膜種植學說是被大眾認可的主要學說之一。該學說不能解釋為何將近76%～90%的婦女存在經(jīng)血逆流，只有10% ～15%左右的婦女發(fā)生EMs，提示還有其它因素決定EMs的發(fā)生、發(fā)展。免疫因素在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用是近幾年研究的熱點。EMs患者體液免疫及細胞免疫均發(fā)生較多改變，體液免疫改變主要體現(xiàn)在抗子宮內膜抗體、抗卵巢抗體等特異性抗體的出現(xiàn)，及抗核抗體、抗磷脂抗體、抗多聚核苷酸等非特異性抗體的出現(xiàn)［3］。細胞免疫改變主要體現(xiàn)在各種免疫細胞及其細胞因子在病灶局部相互作用，使盆腔微環(huán)境的免疫功能發(fā)生改變，不能及時有效的清除粘附種植在腹膜表面的子宮內膜細胞，盆腔內多種細胞因子的作用直接促進了異位內膜細胞的粘附、種植及生長［4］。

Th17細胞是一類新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，幼稚型CD4+T細胞在不同細胞因子誘導下可分化為不同的效應細胞，當微環(huán)境中以TGF-β占優(yōu)勢時通過活化SMAD3通路使幼稚型CD4+T向調節(jié)性T(Treg)細胞分化，當TGF-β和炎性細胞因子IL-6共同存在時啟動STAT3通路促使幼稚型CD4+T向Th17細胞分化，因此TGF-β和IL-6被看作是Th17細胞分化的啟動者［5］。Th17細胞以分泌白介素17(IL-17)為特征，IL-17是促進炎癥發(fā)生的重要細胞因子，能促進機體局部產生趨化因子，從而介導單核細胞和中性粒細胞的迅速聚集［6］。目前認為IL-17在多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病如類風濕性關節(jié)炎(RA)、克羅恩病(Crohn's)、多發(fā)性硬化(MS)等疾病中發(fā)揮重要作用，IL-17可能是這些疾病治療的靶點［7］。IL-6可由巨噬細胞、Th2細胞、及活化的成纖維細胞分泌，是炎癥反應的敏感標記物，參與體內的炎癥反應和免疫調節(jié)［8］。在RA中IL-17能促進滑膜細胞表達IL-6，從而誘發(fā)關節(jié)的慢性炎癥反應及組織損壞［9］。本研究結果提示IL-17在異位內膜細胞表達的陽性率與IL-6成正相關，IL-17在其它細胞因子的共同作用下可能直接促進了異位內膜間質細胞產生IL-6，從而進一步加重局部的炎癥反應，推測EMs可能是一種慢性炎癥性疾病，而IL-17和IL-6所介導的炎癥反應可能是慢性盆腔痛、盆腔炎癥和盆腔粘連的基礎。

已有研究發(fā)現(xiàn)多種細胞可以分泌 TGF-β［10］，如內皮細胞、成纖維細胞、B細胞、T細胞、巨噬細胞等，有促進和抑制腫瘤細胞增殖的雙重作用，在多種腫瘤組織如神經(jīng)膠質瘤、惡性黑色素瘤、乳腺癌等組織中過量表達，在腫瘤微環(huán)境中可抑制樹突狀細胞(DCs)、細胞毒性T細胞(CTL)、NK細胞的活性。目前關于IL-17與TGF-β和IL-6在EMs異位內膜組織相關性的研究較少，本課題結果表明異位內膜組織TGF-β的陽性率高達97%，顯著高于在位內膜及正常內膜，提示異位內膜的間質細胞可能分泌TGF-β，使盆腔微環(huán)境呈現(xiàn)免疫耐受狀態(tài)，有助于異位內膜細胞的粘附、種植和生長，并與IL-6協(xié)同刺激盆腔微環(huán)境中幼稚型CD4+T向Th17細胞分化，增加局部組織IL-17的濃度?？傊琓GF-β可能降低了免疫活性細胞因子的濃度及活性，IL-17與IL-6進一步加重了盆腔內炎癥反應，促進EMs進一步發(fā)展。經(jīng)血逆流是EMs的誘因，盆腔內免疫環(huán)境、細胞因子的改變可能是EMs發(fā)生發(fā)展的直接原因，因此針對上述細胞因子的免疫調節(jié)治療將是EMs治療的靶點。

綜上所述，IL-17、IL-6和TGF-β可能在內異癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了促進作用，但是三者在局部組織相互作用的分子機制及與疾病分期的關系尚需更進一步研究，三者在內異癥患者的表達升高是內異癥疾病的發(fā)病原因還是結果尚不能明確判斷。

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