SHIP和Caspase－3mRNA在骨髓增生異常綜合征患者骨髓組織中的表達(dá)及其臨床意義

賈曉輝，羅建民，劉亞平，尹婉宜，張麗紅

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 石家莊 050000）

SHIP和Caspase－3mRNA在骨髓增生異常綜合征患者骨髓組織中的表達(dá)及其臨床意義

賈曉輝1，羅建民2，劉亞平1，尹婉宜1，張麗紅1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 石家莊 050000）

目的：檢測(cè)骨髓增生異常綜合征（MDS）患者骨髓組織中SHIP、Caspase－3mRNA的表達(dá)，探討其表達(dá)與MDS發(fā)病及向白血病轉(zhuǎn)化過程的關(guān)系。方法：根據(jù)國(guó)際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)（IPSS）選擇62例MDS患者，其中低危（low－risk）組20例、中危1（Int－1）組12例、中危2（Int－2）組13例和高危（high－risk）組17例，采用 RT－PCR法檢測(cè)62例MDS患者及30例健康正常者（對(duì)照組）骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMNC）中SHIP mRNA及Caspase－3mRNA的表達(dá)水平，并分析兩者之間的關(guān)系。結(jié)果：MDS低危組和中危1組BMNC中SHIP mRNA表達(dá)率（100%，100%）及表達(dá)水平（4.467±2.899，4.529±1.975）分別與對(duì)照組（100%，4.623±2.979）比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在中危2組和高危組中，BMNC中SHIP表達(dá)率（92%，88%）下降，表達(dá)水平（2.124±1.880，2.574±1.807）低于對(duì)照組（P＜0.05）。Pearson相關(guān)分析，MDS患者 BMNC中SHIP mRNA 與 Caspase－3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.714，P＜0.05）。隨骨髓原始細(xì)胞比例升高，SHIP mRNA表達(dá)水平降低（F＝3.7，P＜0.05），不同性別（t＝0.940，P＞0.05）、不同年齡（t＝1.419，P＞0.05）患者SHIP mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：SHIP在高危MDS患者BMNC中呈低表達(dá)或不表達(dá)，其表達(dá)水平可以作為判定MDS預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。

骨髓增生異常綜合征；基因表達(dá)；SHIP；聚合酶鏈反應(yīng)

含SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇磷酸酶（SH2domaincontaining inositol 5′－phosphatase，SHIP）蛋白是肌醇5′磷酸酯酶家族中的重要一員，位于人類染色體2q36－q37.1。目前研究［1－2］表明：SHIP 基因在造血細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展和功能方面起關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用，在抑制白血病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）為一組異質(zhì)性疾病，高風(fēng)險(xiǎn)向急性白血病轉(zhuǎn)化是其特征，其發(fā)病、疾病進(jìn)展機(jī)制尚不完全明確。目前有關(guān)SHIP基因與MDS疾病進(jìn)展機(jī)制研究國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。本研究采用RTPCR法檢測(cè)各組MDS患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）SHIP和半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶－3（Caspase－3）mRNA表達(dá)水平，探討其在MDS患者骨髓中的表達(dá)及其與MDS發(fā)病及向白血病轉(zhuǎn)化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年9月—2012年10月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院血液內(nèi)科收治的MDS患者［3］62例，其中男性32例，女性30例，中位年齡62歲；根據(jù)國(guó)際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)（IPSS）積分分組和評(píng)價(jià)預(yù)后，其中低危（low－risk）組20例，中危1（Int－1）組12例，中危2（Int－2）組13例，高危（highrisk）組17例。對(duì)照組為30例健康志愿者，其中男性17例，女性13例，中位年齡為31歲。

1.2 治療方法 低危組、中危1組患者給予粒細(xì)胞集落刺激因子（G－CSF）、促紅細(xì)胞生成素（EPO）、十一酸睪酮、沙利度胺、全反式維甲酸和成分輸血等治療。中危－2組及高危組患者給予標(biāo)準(zhǔn)或減量的柔紅霉素、阿糖胞苷（DA方案），阿克拉霉素、阿糖胞苷和G－CSF（CAG方案）等化療方案及支持治療。

1.3 檢測(cè)方法 治療前的MDS患者和健康對(duì)照者均采集新鮮骨髓液4mL，用淋巴細(xì)胞分離液提取BMNC備用。提取細(xì)胞總RNA，用隨機(jī)六聚引物合成cDNA：在20μL反應(yīng)體積中加入1μg總RNA，37℃、60min反轉(zhuǎn)錄，95℃、5min終止反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體積25μL，含cDNA、MgCl2、4種dNTPs、引物和 Taq酶。引物由美國(guó)Cybersyn公司合成。GAPDH擴(kuò)增條件：94℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，22個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；SHIP擴(kuò)增條件：94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；Caspase－3擴(kuò)增條件：94℃變性40s，68℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，100℃、10min滅活Taq酶。產(chǎn)物分析：取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物，10g·L－1瓊脂糖凝膠電泳（90V、40min），溴化乙錠染色，紫外透射儀觀察結(jié)果并拍照，采用凝膠圖像分析術(shù)進(jìn)行掃描并定量，結(jié)果以SHIP、Caspase－3mRNA與GAPDH mRNA光密度比值表示。

1.4 目的引物的合成 以GAPDH為內(nèi)參照基因，引物由美國(guó)Cybersyn公司合成。見表l。

表1 RT－PCR引物序列Tab.1 The sequences of RT－PCR primers

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。SHIP、Caspase－3表達(dá)率組間比較采用χ2檢驗(yàn)；SHIP、Caspase－3表達(dá)水平組間比較采用單因素方差分析。在MDS患者中SHIP mRNA與 Caspase－3mRNA 相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者BMNC中SHIP mRNA表達(dá)率和表達(dá)水平 SHIP mRNA表達(dá)率：低危組20例患者均呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為100%；中危－1組12例患者均呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為100%；中危－2組13例中12例呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為92%；高危組17例患者中15例呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為88%；對(duì)照組30例患者均呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為100%。MDS各組分別與對(duì)照組比較，SHIP mRNA表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.796，P＞0.05）；SHIP mRNA表達(dá)水平：低危組為4.467±2.899，中危1組為4.529±1.975，中危2組為2.124±1.880，高 危 組 為 2.574±1.807，對(duì) 照 組 為4.623±2.979。低危、中危1組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中危2組和高危組低于對(duì)照組（P＜0.05），見表2。各組 SHIP基因（238bp）及 GAPDH 基因 （358bp）特定片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1～5。

圖1 對(duì)照組SHIP基因表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in control group

2.2 各組患者BMNC中Caspase－3mRNA表達(dá)率和表達(dá)水平 Caspase－3mRNA表達(dá)率：5組患者Caspase－3mRNA表達(dá)率均為100%，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；Caspase－3mRNA表達(dá)水平：低危組為1.954±0.972，中危1組為2.068±0.983，中危2組為1.254±0.756，高危組為1.206±0.685，對(duì)照組為2.041±1.118。低危、中危1組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中危2組、高危組低于對(duì)照組 （P＜0.05）。見表3。

圖2 低危組SHIP基因表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in low－risk group

圖3 中危1組SHIP基因表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in Int－1group

圖4 中危2組SHIP基因表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in Int－2group

圖5 高危組SHIP基因表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in high－rish group

2.3 SHIP mRNA 與 Caspase－3mRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性分析 MDS患者中SHIP mRNA與Caspase－3mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系 （r＝0.714，P＜0.05）。

2.4 SHIP mRNA表達(dá)水平與MDS患者臨床參數(shù)的關(guān)系 MDS患者隨骨髓原始細(xì)胞比例升高SHIP mRNA 表達(dá)水平降低 （F＝3.700，P＜0.05），不同性別、不同年齡患者SHIP mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見表4。

表2 各組SHIP mRNA的表達(dá)水平Tab.2 The expression levels of SHIP mRNA in various groups

表3 各組Caspase－3mRNA的表達(dá)水平Tab.3 The expression levels of Caspase－3mRNA in various groups

表4 不同臨床參數(shù)MDS患者SHIP mRNA表達(dá)水平比較Tab.4 Comparisons of the expression levels of SHIP mRNA in MDS patients with different clinical parameters

3 討 論

MDS是克隆性的造血干／祖細(xì)胞疾病，其主要臨床特征是無效造血、外周血細(xì)胞減少和高風(fēng)險(xiǎn)向急性白血病轉(zhuǎn)化，尤其高危MDS患者治療效果差、預(yù)后差，30%～50%MDS患者會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙园籽。乙约毙运杓?xì)胞白血病為主［4－6］。但是目前對(duì)MDS的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不十分明確。

Luo等［2，7］于2003年發(fā)現(xiàn)了急性白血病患者存在SHIP基因功能結(jié)構(gòu)域突變。SHIP廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞。SHIP通過調(diào)控造血祖細(xì)胞的存活與增殖，在抑制白血病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，SHIP的表達(dá)水平和（或）活性的降低，可能是髓系白血病克隆增殖的先決條件［8］。

本研究根據(jù)IPSS積分系統(tǒng)將MDS分為低危組、中危1組、中危2組、高危組，前2組患者預(yù)后相對(duì)較好，治療以改善生活質(zhì)量為治療目的；后2組患者預(yù)后差，以延長(zhǎng)存活時(shí)間為治療目的。本研究結(jié)果顯示：MDS患者BMNC中SHIP、Caspase－3mRNA在低危組、中危1組的表達(dá)水平與健康人群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在中危2組、高危組的表達(dá)水平明顯低于健康人群。SHIP、Caspase－3mRNA表達(dá)水平的下降，與IPSS評(píng)分上升相符，可以做為MDS的預(yù)后指標(biāo)。Pearson相關(guān)性分析顯示：SHIP mRNA 與 Caspase－3 mRNA在MDS中的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。在中危2組、高危組患者中，部分患者進(jìn)展為白血病，可能與SHIP活性下降和（或）缺失、削弱了PI3K途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用及導(dǎo)致了白血病細(xì)胞克隆的增殖有關(guān)。SHIP特異地清除PIP3，使下游分子信號(hào)AKT激活，AKT磷酸化水平增強(qiáng)，Akt／PKB可直接催化Caspase－3磷酸化使之失活，抑制Caspase促細(xì)胞凋亡的作用。Caspase－3促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡，并在其中起著關(guān)鍵作用也已得到證實(shí)［9－11］。

SHIP mRNA表達(dá)水平與MDS患者的年齡、性別無明顯關(guān)聯(lián)性，但其與骨髓中原始細(xì)胞比例有關(guān)，SHIP mRNA表達(dá)水平高原始細(xì)胞組低于低原始細(xì)胞組。Lee等［12］研究表明：高危MDS患者常伴有SHIP－1蛋白表達(dá)水平下降。MDS和急性白血病具有相似的發(fā)病機(jī)制［13］，SHIP、Caspase－3 mRNA表達(dá)水平的下降，在白血病的發(fā)病機(jī)制中已得到證實(shí)［14－15］。SHIP mRNA 在 MDS患者骨髓組織中的表達(dá)水平下降，可能是MDS轉(zhuǎn)化為白血病發(fā)病過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

SHIP基因的活性下降和（或）缺失與白血病的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后和治療效果有密切關(guān)聯(lián)。因此，密切觀察SHIP和Caspase－3基因的表達(dá)水平，探討其在MDS中可能發(fā)揮的作用及作用機(jī)制，既可以作為評(píng)估MDS進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)，又可以提供預(yù)測(cè)MDS向白血病轉(zhuǎn)化危險(xiǎn)性的指標(biāo)。

［1］Rohrschneider LR，F(xiàn)uller JF， Wolf I，et al.Structure，function，and biology of SHIP proteins ［J］.Genes Dev，2000，14（5）：505－520.

［2］Luo JM，Yoshida H，Komura S，et al.Possible dominantnegative mutation of the SHIP gene in acute myeloid leukemia［J］.Leukemia，2003，17（1）：1－8.

［3］張之南，沈 悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：157－163.

［4］王淋淋，高 沖，陳寶安.MDS轉(zhuǎn)化為AML機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2011，19（1）：254－259.

［5］Jian Y，Dunbar A，Gondek LP，et al.Aberrant DNA methylation is a dominant mechanism in MDS progression to AML［J］.Blood，2009，113（6）：1315－1325.

［6］廖榮霞，諶諧婉，詹小青，等.miRNA調(diào)控骨髓增生異常綜合征的發(fā)生發(fā)展［J］.生命的化學(xué)，2012，32（1）：52－54.

［7］羅建民，劉澤林，郝洪嶺，等.急性白血病細(xì)胞SHIP基因的突變分析 ［J］.中華血液學(xué)雜志，2004，25（7）：385－388.

［8］譚 博，張殿政，陳漢春.SHIP蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性及其與白血病的關(guān)系［J］.生命的化學(xué)，2011，31（2）：244－247.

［9］尚振川，宋霆婷，孫秉中，等.Caspase－3在慢性粒細(xì)胞白血病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用［J］.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2009，23（1）：44－46.

［10］劉小軍，楊 琳，溫樹鵬，等.SHIP基因突變對(duì)白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞遷移及侵襲的影響［J］.中華血液學(xué)雜志，2012，33（1）：38－42.

［11］李曉花，薛天陽(yáng)，許 偉，等.Caspase3在 MG－132誘導(dǎo)白血病L1210細(xì)胞凋亡過程中的作用［J］.中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志，2010，15（3）：112－114.

［12］Lee DW，F(xiàn)utami M，Carroll M，et al.Loss of SHIP－1 protein expression in high－risk myelodysplastic syndromes is associated with miR－210and miR－155［J］.Oncogene，2012，31（37）：4085－4094.

［13］尹冬梅，許洪志，張婧瑤，等.AA、MDS和 AML患者CD4＋T細(xì)胞亞群的變化及其臨床意義［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，50（3）：66－70.

［14］Kedar R，Sabag O，Licthenstein M，et al.Soluble CD40 ligand（sCD40L）provides a new delivery system for targeted treatment：sCD40L－Caspase 3chimeric protein for treating B－cell malignancies［J］.Cancer，2012，118（24）：6089－6104.

［15］楊 琳，羅建民，劉小軍，等.SHIP基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及其表達(dá)抑制白血病細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)生物工程雜志，2009，29（6）：14－19.

Expressions of SHIP and Caspase－3mRNA in bone marrow tissue of patients with myelodysplastic syndrome and their clinical significances

JIA Xiao－h(huán)ui1，LUO Jian－min2，LIU Ya－ping1，YIN Wan－yi1，ZHANG LI－h(huán)ong1
（1.Department of Hematology，F(xiàn)irst Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China；2.Department of Hematology，Second Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To detect the expressions of SHIP mRNA and Caspase－3mRNA in bone marrow tissue of the patients with myelodysplastic syndrome（MDS）and to discuss the relationship between SHIP mRNA and Caspase－3 mRNA expressions and the occurrence and development of MDS.Methods 20low－risk MDS cases（low－risk group），12Int－1MDS cases（Int－1group），13Int－2MDS cases（Int－2group），and 17high－risk MDS cases（highrisk group）were selected according to International Prognostic Scoring Syterm（IPSS）.30healthy volunteers were regared as control group.The expression levels of SHIP mRNA and Caspase－3mRNA in bone marrow mononuclear cells（BMNC）in various groups were detected by RT－PCR method，and the relationship between them was analyzed.Results The positive rates of SHIP mRNA were 100%and 100%and its expression levels were 4.467±2.899and 4.529±1.975in low－risk group and Int－1group，respectively，while they were 100%and 4.623±2.979in control group，so there were no significant differences between low－risk group，Int－1group and control group（P＞0.05）.The positive rates of SHIP mRNA were 90%and 88%and the expression levels were 2.124±1.880and 2.574±1.807in Int－2group and high－risk group，respectively，so there were significantly differences compared with control group （P＜0.05）.The Pearson correlation analysis results showed that the positive correlations were found between the level of SHIP mRNA and the level of Caspase－3mRNA in MDS patients（r＝0.714，P＞0.05）.The expression level of SHIP mRNA was decreased with the increasing of premitive cells（F＝3.7，P＜0.05）.There were no significant differences of SHIP mRNA expression levels of patients between different genders（t＝0.940，P＞0.05）and different ages（t＝1.417，P＞0.05）.Conclusion The expression level of SHIP is lower or the SHIP doesn’t express in BMNC of the high－risk MDS patients，and its expression level can be used as an indicator to judge the prognosis of MDS.

myelodysplastic syndrome；gene expression；SH2domain－containing inositol 5’－phosphatase；polymerase chain reactiom

R551.3

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0554－05

10.7694／jldxyxb20130327

2013－02－04

河北省自然科學(xué)基金資助課題 （H2012206139）

賈曉輝 （1970－），男，河北省武強(qiáng)縣人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事惡性血液病的基礎(chǔ)與臨床研究。

羅建民 （Tel：0311－66003927，E－mail：luojm315＠yahoo.com.cn）