NK細胞與CIK細胞體外誘導(dǎo)擴增及其活性比較

趙楊祉，崔久嵬，徐東升，牛 超，金浩范，梁婷婷，李 紅，王冠軍，李 薇

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021）

NK細胞與CIK細胞體外誘導(dǎo)擴增及其活性比較

趙楊祉，崔久嵬，徐東升，牛 超，金浩范，梁婷婷，李 紅，王冠軍，李 薇

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021）

目的：探討體外誘導(dǎo)和擴增NK細胞和CIK細胞的方法，比較二者的增殖能力及其對腫瘤細胞的殺傷活性。方法：提取腫瘤患者外周血單個核細胞（PBMCs），在細胞因子誘導(dǎo)下培養(yǎng)NK細胞和CIK細胞。觀察2種細胞的形態(tài)學(xué)變化，采用流式細胞術(shù)檢測CD3－CD56＋NK細胞和CD3＋CD56＋CIK細胞比例，計算細胞擴增倍數(shù)；采用ELISA法檢測NK細胞和CIK細胞分泌干擾素－γ（IFN－γ）的水平；采用CCK－8法檢測NK和CIK細胞對K562細胞株的殺傷活性。結(jié)果：經(jīng)過14d體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，NK細胞擴增（160.00±12.15）倍，CIK細胞擴增（110.00±15.48）倍，NK細胞的擴增能力強于CIK細胞（P＜0.05）；NK和CIK細胞分泌IFN－γ量分別為（4 227.75±731.94）和（525.96±304.84）μg·L－1，NK細胞分泌IFN－γ的能力強于CIK細胞（P＜0.01）；誘導(dǎo)擴增后NK和CIK細胞對K562細胞株具有較強的殺傷活性，隨著效靶比的升高殺傷活性增強。在效靶比為25∶1時，NK細胞和CIK細胞對K562細胞的殺傷率分別為65.35%和57.68%，NK細胞的殺傷活性強于CIK細胞（P＜0.01）。結(jié)論：在體外成功建立了NK細胞和CIK細胞的誘導(dǎo)擴增體系，NK細胞的擴增能力、IFN－γ分泌水平以及其對K562細胞株的殺傷作用均強于CIK細胞。

自然殺傷細胞；細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞；殺傷活性

近年來，隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細胞生物治療已經(jīng)成為腫瘤治療的第4種模式。常用的免疫細胞主要有細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）和自然殺傷細胞（natural killer cells，NK）等［1］。目前相關(guān)研究［2－3］已表明：能夠在體外誘導(dǎo)擴增獲得大量的CIK細胞，CIK細胞對于急慢性髓系白血病和多種實體腫瘤具有一定的臨床療效。但是對于NK細胞的體外誘導(dǎo)擴增和二者體外活性的對比研究則較少，高質(zhì)量NK細胞的獲得及其抗瘤活性的不明確仍是限制其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。本研究在體外成功誘導(dǎo)擴增NK細胞和CIK細胞，并比較了二者的體外活性，旨在為其進一步的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標本來源及細胞株 選取2011年7月1日—8月1日就診于本科的腫瘤患者27例（其中肺癌患者10例，胃癌患者10例，乳腺癌患者7例），男性15例，女性12例，中位年齡55歲。其中Ⅰ－Ⅱ期腫瘤患者17例，Ⅲ－Ⅳ期患者10例。K562細胞株為本實驗室凍存細胞株，用含有10%FCS的RPMI－1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，每2～3d換液1次。

1.2 主 要 試 劑 及 儀 器 rhIFN－γ、rhIL－2、rhIL－12和 rhIL－15（Peprotech 公 司， 美 國 ）， 抗CD3McAb（Neo Markers公司，美國），胎牛血清FCS（Sigma公司，美國），DMSO（上海華壹生物科技有限公司），淋巴細胞分離液（Mediatech公司，美國），IFN－γELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），CCK－8試劑盒（同仁公司，日本），RPMI－1640培養(yǎng)液、AIM－V無血清培養(yǎng)液（Gibico 公 司， 美 國 ），CD3－APC、CD56－PE 和CD16－FITC流式細胞熒光標記抗體（BD公司，美國）。倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），流式細胞儀（BD公司，美國），離心機（上海森信實驗儀器有 限 公 司），CO2培 養(yǎng) 箱 （RCO－3000TVBB，RECO公司，美國），生物安全柜（Thermo公司，美國），96孔細胞培養(yǎng)板（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）。

1.3 外周血單核細胞的分離 抽取腫瘤患者靜脈血10mL，肝素抗凝，PBS液等體積稀釋，用淋巴細胞分離液進行密度梯度離心（1 800r·min－1、22℃、30min），獲取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），用RPMI－1640培養(yǎng)基洗滌2次，然后用AIM－V培養(yǎng)液懸浮細胞。

1.4 NK細胞的體外誘導(dǎo)擴增 將PBMCs密度調(diào)整為2×106mL－1，先后加入含有抗CD3McAb、rhIL－2、IL－12和IL－15的 AIM－V 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3d半量換液，并補充相應(yīng)的細胞因子和自體血漿。

1.5 CIK細胞的體外誘導(dǎo)擴增 將PBMCs密度調(diào)整為2×106mL－1，加入rhIFN－γ（終濃度為1 000IU·mL－1），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后加入抗CD3McAb（終濃度為50mg·L－1）和rhIL－2（終濃度為1 000IU·mL－1）繼續(xù)培養(yǎng)。每2～3d半量換液，并補加相應(yīng)的細胞因子和自體血漿。

1.6 NK和CIK細胞體外增殖觀察 在培養(yǎng)過程中每天觀察細胞的形態(tài)、數(shù)量和生長狀況等變化。在培養(yǎng)第7和14天分別收集NK和CIK細胞，用PBS液洗滌2次，將細胞濃度調(diào)整為5×106mL－1，取100μL細胞懸液置流式細胞儀專用試管中，加入CD3－APC和CD56－PE鼠抗人單克隆抗體，于室溫下避光孵育15min，PBS液洗滌2次，300μL PBS懸起細胞，采用流式細胞術(shù)進行檢測。

1.7 細胞因子IFN－γ分泌水平檢測 分別收集培養(yǎng)第14天的NK和CIK細胞，將細胞濃度調(diào)整為5×105mL－1，取200μL加入96孔板中，每組設(shè)雙復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按照IFN－γELISA試劑盒說明書操作，檢測培養(yǎng)液中IFN－γ水平。

1.8 NK和CIK細胞對K562細胞株殺傷活性檢測 取對數(shù)生長期K562細胞，離心換液后將細胞濃度調(diào)整為4×105mL－1，將細胞輕輕吹打混勻后，接種于96孔板中，每孔100μL細胞懸液。按照效靶比6∶1、12∶1和25∶1分別調(diào)整NK和CIK細胞濃度，接種于96孔板，每孔100μL。鋪板后將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，每孔加入20μL CCK8溶液，37℃孵育1.5h，利用酶標儀在450nm處檢測吸光度（A）值。按照如下公式計算效應(yīng)細胞的殺傷活性：殺傷活性（%）＝［靶細胞對照組A值－（實驗組A值－效應(yīng)細胞對照組A值）］／靶細胞對照組A值×100。靶細胞對照組為單純K562細胞，效應(yīng)細胞對照組為單純CIK細胞或單純NK細胞，實驗組為CIK細胞＋K562細胞或NK細胞＋K562細胞。1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。NK、CIK細胞比例和IFN－γ分泌水平以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 誘導(dǎo)前后NK和CIK細胞形態(tài)學(xué) 誘導(dǎo)前PBMCs細胞體積較小，呈圓形；在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，PBMCs細胞體積逐漸變大，細胞漿越來越豐富，細胞核逐漸增大；第3～4天細胞開始聚集，成簇狀克隆樣生長；此后細胞增殖更加顯著，至第7天時胞體出現(xiàn)突起，且不規(guī)則。CIK和NK細胞形態(tài)相似，部分呈幼稚的淋巴細胞，有的似成熟的大淋巴細胞，并可見細胞克隆團。

2.2 NK和CIK細胞增殖情況 來自腫瘤患者的PBMCs能夠在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)出NK和CIK細胞，培養(yǎng)后NK和CIK細胞所占比例明顯提高。NK細胞在培養(yǎng)的3～5d即出現(xiàn)增殖變化，而CIK細胞在培養(yǎng)7～10d出現(xiàn)增殖變化。在培養(yǎng)14d時，NK 細胞所占比例達（65.33±25.22）%，擴增（160.00±12.15）倍；CIK 細胞所占比例達（35.67±15.23）%，擴增（110.00±15.48）倍，NK細胞的誘導(dǎo)擴增效果明顯優(yōu)于CIK細胞（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 不同培養(yǎng)時間NK細胞和CIK細胞所占比例比較Tab.1 Comparison of the proportion of NK and CIK cells at different culture time ［n＝20，（±s）／%］

表1 不同培養(yǎng)時間NK細胞和CIK細胞所占比例比較Tab.1 Comparison of the proportion of NK and CIK cells at different culture time ［n＝20，（±s）／%］

＊P＜0.05 vs CD3－CD56＋ NK group.

0 7 14 CD3－CD56＋NK Group Cell proportion（t／d）6.23±3.45 41.24±6.57 65.33±25.22 CD3＋CD56＋CIK 2.56±0.19 12.54±2.76＊ 35.67±15.23＊

圖1 誘導(dǎo)前后NK細胞和CIK細胞檢測流式細胞圖Fig.1 Flow cytometry graph of NK and CIK cells before and after induction

2.3 NK和CIK細胞分泌IFN－γ水平比較 在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，NK和CIK細胞分泌IFN－γ量分 別 為 （4 227.75±731.94） 和 （525.96 ±304.84）μg·L－1，NK細胞IFN－γ的分泌水平明顯高于CIK細胞 （P＜0.01）。

2.4 效應(yīng)細胞作用前后K562細胞的形態(tài)學(xué)變化倒置顯微鏡下，正常的K562細胞體積較大，胞膜完整，折光性好，生長旺盛；加入效應(yīng)細胞24h后，效應(yīng)細胞聚集在K562細胞周圍，部分效應(yīng)細胞融合脹大并發(fā)生吞噬作用。K562細胞輪廓模糊，細胞外形皺縮，細胞出現(xiàn)裂解。見圖2和3。

2.5 NK和CIK細胞對K562細胞殺傷活性比較將體外培養(yǎng)的效應(yīng)細胞分別與靶細胞作用，隨著效靶比的升高，殺傷活性增強。在相同效靶比情況下，NK細胞對K562細胞的殺傷作用強于CIK細胞。在效靶比為25∶1時，NK細胞和CIK細胞對K562細胞的殺傷率分別為65.35%和57.68%，NK細胞的殺傷活性強于CIK細胞（P＜0.01）。見圖4。

圖2 正常K562細胞的形態(tài)（×400）Fig.2 Morphology of normal K562cells（×400）

圖3 效應(yīng)細胞作用24h后K562細胞的形態(tài)（×400）Fig.3 Morphology of K562cells after treated with effector cells for 24h（×400）

圖4 不同效靶比時NK和CIK細胞對K562細胞殺傷活性Fig.4 Killing activities of NK and CIK cells against K562 cells at different effector－target ratios

3 討 論

NK細胞是機體對抗病原體侵襲和正常細胞惡變的一種重要的天然免疫細胞，無需預(yù)先接觸腫瘤特異性抗原即可殺傷腫瘤細胞［4］，對腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移擴散均具有 “抑制”作用［5－6］。NK細胞能夠清除術(shù)后微小殘留病灶，降低復(fù)發(fā)［7］，因而被認為是腫瘤免疫治療的重要免疫細胞。CIK細胞是由多種細胞因子，如IFN－γ、IL－2和抗CD3McAb等誘導(dǎo)而成的細胞毒性T淋巴細胞［8］。由于CIK細胞同時表達CD3和CD56 2種膜蛋白分子，因而又被稱為 “NK細胞樣T淋巴細胞”，同時具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性以及NK細胞非主要組織相容性復(fù)合體 （MHC）限制性的殺瘤特性［9］。目前，多項臨床研究［10－11］顯示：CIK細胞對急慢性髓系白血病、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、腸癌和食道癌等多種惡性腫瘤均有一定的療效。目前CIK細胞的體外誘導(dǎo)擴增技術(shù)已經(jīng)比較成熟，但是如何在體外大量獲得NK細胞及其抗瘤活性尚不夠明確，仍是限制NK細胞臨床應(yīng)用的瓶頸［12］。本研究在應(yīng)用多種細胞因子條件下，成功地在體外將NK細胞擴增激活，在培養(yǎng)14d時NK細胞出現(xiàn)增殖高峰，較培養(yǎng)0d時增加 （160.00±12.15）倍，而CIK細胞在體外培養(yǎng)14d時增加 （110.00±15.48）倍，提示可以在培養(yǎng)14d時進行細胞回輸。NK細胞和CIK細胞不僅可通過細胞毒作用直接殺傷腫瘤細胞，而且可以通過分泌細胞因子IFN－γ間接發(fā)揮抗腫瘤活性［13－15］。本研究表明：NK細胞分泌IFN－γ的能力強于CIK細胞，預(yù)示著NK細胞在臨床上可能會有更好的治療效果。

體外誘導(dǎo)擴增的NK細胞和CIK細胞對K562細胞均顯示出了明顯的殺傷活性，進一步證實了NK細胞和CIK細胞的非MHC限制性的抗瘤特性。隨著效靶比的增加，NK細胞和CIK細胞對K562細胞的殺傷活性亦顯著增強，并且NK細胞對K562細胞的殺傷活性強于CIK細胞，這可能與NK細胞分泌IFN－γ的能力強于CIK細胞有關(guān)。

腫瘤患者機體免疫功能受抑制，免疫細胞的數(shù)量和活性均降低，本研究對腫瘤患者自體免疫細胞進行體外誘導(dǎo)擴增，獲得了大量具有較強殺傷活性的NK和CIK細胞，本研究結(jié)果為體外大量獲得免疫效應(yīng)細胞應(yīng)用于腫瘤免疫治療提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

［1］Sangiolo D. Cytokine induced killer cells as promising immunotherapy for solid tumors ［J］. Cancer，2011，2 （3）：363－368.

［2］Yeh CL，Kam Hui.Cytokine－induced NK－like T cells：from bench to bedside［J］.Biomed Biotechnol，2010，10 （10）：435745－435753.

［3］Pievani A，Belussi C，Christian K，et al.Enhanced killing of human B－cell lymphoma targets by combined use of cytokineinduced killer cell （CIK ） cultures and anti－CD20 antibodies ［J］.Blood，2011，117 （2）：510－518.

［4］Gonzales CM， Williams CB， Calderon VE， et al.Antibacterial role for natural killer cells in host defense to Bacillus anthracis ［J］.Infect Immun，2012，80 （1）：234－242.

［5］Geller MA，Cooley S，Judson PL，et al.A phaseⅡstudy of allogeneic natural killer cell therapy to treat patients with recurrent ovarian and breast cancer［J］.Cytotherapy，2011，13 （1）：98－107.

［6］Triplett BM，Horwitz EM，Lyengar R，et al.Effects of activating NK cell receptor expression and NK cell reconstitution on the outcomes of unrelated donor hematopoietic cell transplantation for hematologic malignancies ［J］.Leukemia，2009，23 （7）：1278－1287.

［7］Cho D，Campana D.Expansion and activation of nature killer cells for cancer immnotherapy ［J］.Lab Med，2009，29 （2）：89－96.

［8］Kim HM，Kang JS，Lim J，et al.Antitumor activity of cytokine－induced killer cells in nude mouse xenograft model［J］.Pharm Res，2009，32 （5）：781－787.

［9］He M，Wang Y，Shi WJ，et al.Immunomodulation of inducible co－stimulator （ICOS）in hu－man cytokine－induced killer cells against cholangiocarcinoma through ICOS／ICOS ligand interaction［J］.Digest Dis，2011，12 （5）：393－400.

［10］Zhong R，Teng J，Han B，et al.Dendritic cells combining with cytokine induced killer cells synergize chemotherapy in patients with late－stage non－small cell lung cancer［J］.Cancer Immunol Immunother，2011，60 （10）：1497－1502.

［11］Zhang JP，Mao GH，Han YP，et al.The clinical effects of DC－CIK cells combined with chemotherapy in the treatment of advanced NSCLC［J］.Clin Oncol，2012，11 （2）：67－71.

［12］Sun JC，Beilke JN，Lanier LL.Adaptive immune features of natural killer cells［J］.Nature，2009，457 （7229）：557－561.

［13］Pievani A，Borleri G，Pende D，et al. Dual－functional capability of CD3＋CD56＋CIK cells，a T－cell subset that acquires NK function and retains TCR－mediated specific cytotoxicity ［J］.Blood，2011，118（12）：3301－3310.

［14］趙 磊，王念躍，張紅梅.AIDS患者與正常人CD8＋CD25＋、CD4＋CD25＋、B淋巴細胞、NK細胞與NKT細胞計數(shù)對照研究 ［J］.中國實驗診斷學(xué)，2012，16 （10）：1857－1859.

［15］艾金霞，崔煥波.SBHL對S180荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫功能的影響 ［J］.中國實驗診斷學(xué)，2010，14 （6）：828－830.

Induction and expansion of NK and CIK cellsinvitroand comparison of their activities

ZHAO Yang－zhi，CUI Jiu－wei，XU Dong－sheng，NIU Chao，JIN Hao－fan，LIANG Ting－ting，LI Hong，WANG Guan－jun，LI Wei
（Cancer Center，F(xiàn)irst Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To explore the methods to induce and expand the NK and CIK cellsinvitroand to compare the proliferation abilities and anti－tumor activities of NK and CIK cells.Methods Peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）were separated from the peripheral blood of cancer patients.The PBMCs were induced by cytokines to culture NK and CIK cells.The morphological changes of NK and CIK cells were observed.The percentages of CD3－CD56＋NK and CD3＋CD56＋CIK cells were detected by flow cytometry.And the expansion folds of NK and CIK cells were calculated.The levels of interferon－γ（IFN－γ）secreted by NK and CIK cells were detected by ELISA method.And the killing activities of NK and CIK cells against K562cell strain were detected by CCK－8method.Results After induction and expansioninvitrofor 14d，the NK cells expanded（160.00±12.15）folds，and the CIK cells expanded（110.00±15.48）folds.The expansion ability of the NK cells was higher than that of the CIK cells（P＜0.05）.The secretion levels of IFN－γin the supernatant of NK and CIK culture system raised to（4 227.75±731.94）and（525.96±304.84）μg·L－1，respectively.The secretion level of IFN－γof the NK cells was higher than that of the CIK cells（P＜0.01）.After induction and expansion，the cytotoxicities of NK and CIK cells against K562cells were enhanced with the increase of effector－target ratio.The killing rates of NK and CIK cells against K562cells were 65.35%and 57.68%at 25∶1effector－target ratio，respectively.The killing activity of NK cells was higher than that of CIK cells at the same effector－target ratio（P＜0.01）.Conclusion The induction and expansion system of NK and CIK cellsinvitrois established successfully，and the expansion capability，the secretion level of IFN－γ，and the cytotoxicity of the NK cells are higher than those of the CIK cells.

natural killer cells；cytokine induced killer cells；killing activity

R733

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0477－05

10.7694／jldxyxb20130311

2012－10－25

教育部科研基金資助課題 （311015）；吉林省財政廳科研基金資助課題 （3D5116523428）；吉林省科技廳科研基金資助課題 （20100749）

趙楊祉 （1985－），女，吉林省長春市人，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事腫瘤免疫治療研究。

李 薇 （Tel：0431－88782794，E－mail：drweili＠yahoo.com）