Nrf2／NQO1信號通路在胃癌干細胞氧化應激反應中的作用機制

陳 浩，許 浪

（1.湖北省荊州市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 荊州 434100；2.武漢科技大學醫(yī)學院病理學教研室，湖北 武漢 430065）

Nrf2／NQO1信號通路在胃癌干細胞氧化應激反應中的作用機制

陳 浩1，許 浪2

（1.湖北省荊州市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 荊州 434100；2.武漢科技大學醫(yī)學院病理學教研室，湖北 武漢 430065）

目的：觀察核因子E2相關因子2（Nrf2）、醌氧化還原酶（NQO1）在胃癌干細胞和正常胃黏膜組織中的表達，探討Nrf2／NQO1信號通路在胃癌干細胞氧化應激反應中的作用機制。方法：采用腫瘤球懸浮分選法從60例胃癌組織標本中分選胃癌干細胞，干細胞隨機分為干細胞初分組和激活組。30例正常胃黏膜組織作為對照。采用Western blotting法檢測各組Nrf2、NQO1蛋白表達水平和超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性。結果：與正常對照組比較，干細胞初分組和激活組Nrf2、NQO1的表達水平升高（P＜0.05），SOD活性顯著降低，MDA活性則顯著升高（P＜0.05）；與干細胞初分組比較，激活組Nrf2、NQO1的表達水平顯著升高（P＜0.05），SOD活性顯著增強，MDA活性顯著下降（P＜0.05）。結論：激活Nrf2／NQO1通路可以調節(jié)胃黏膜組織中SOD和MDA的活性，增強細胞對氧化應激的耐受性，發(fā)揮保護細胞的作用。

Nrf2／NQO1信號通路；氧化應激；胃癌干細胞；超氧化物歧化酶；丙二醛

胃癌是消化系常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制十分復雜。國外研究［1］表明：腫瘤干細胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系，對腫瘤的轉移、復發(fā)和預后也起到?jīng)Q定性作用。研究［2］表明：胃癌發(fā)生部位與胃癌干細胞定居部位一致，且具有許多共同特性，提示胃癌可能是一種干細胞疾病。無論是正常細胞還是腫瘤細胞都趨于維持還原穩(wěn)態(tài)以保證自身的生長和增殖，而調節(jié)抗氧化應激反應的重要轉錄因子核因子E2相關因子2（nuclear factor E2－related factor 2，Nrf2）在這種穩(wěn)態(tài)的維持中起關鍵作用。研究［3］表明：Nrf2可保護肺臟、肝臟、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等多種器官或組織。醌氧化還原酶（NADPH quinine oxidoreductase，NQO1）是Nrf2的下游抗氧化酶基因，與內源或外源物質代謝與轉運相關。本研究通過觀察胃癌干細胞組織Nrf2／NQO1信號通路中Nrf2、NQO1的表達及其二相解毒酶基因超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）活性變化，探討該信號通路在胃癌干細胞氧化應激反應中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 60例標本組織來源于2008年3月—2011年10月本院行胃腸外科手術切除且經(jīng)病理診斷證實為胃癌的標本，其中男性35例，女性25例，年齡38～75歲，平均年齡（51.6±2.4）歲。依據(jù) WHO診斷標準由本院病理科進行病理診斷。30例正常胃黏膜組織來自2007年8月—2011年5月本院胃鏡室活檢標本，其中男性18例，女性12例，年齡40～73歲，平均年齡（53.1±2.6）歲。標本取出后均立即經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后封存。所有患者材料均經(jīng)家屬同意，并有知情同意書。獲本院道德及倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 1640培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、標準FBS和EDTA由北京中杉金橋公司提供；胰蛋白酶、新生牛血清、40μm篩網(wǎng)均由武漢御和生物有限公司提供；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）和CD44鼠抗人單克隆抗體均由德國Merck公司提供；Nrf2、NQO1和兔多克隆抗體由上海研晶生物試劑有限公司提供；姜黃素由美國Gibco公司提供；Western blotting顯色劑由法國Pierce公司提供；SOD、MDA檢測試劑盒由南京建成生物技術有限公司提供。

1.3 胃癌干細胞的原代培養(yǎng)、分化及鑒定 無菌條件下取腫瘤標本，常規(guī)二甲苯脫蠟梯度酒精至水洗，剔除血管和壞死組織，以PBS沖洗后，無血清1640培養(yǎng)液中銳性分離，以0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清終止消化，篩網(wǎng)過濾。離心后去上清，以含10%FBS的1640培養(yǎng)液重懸細胞，置于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，次日換液。待細胞長滿瓶底時傳代、培養(yǎng)。收集胃癌懸浮細胞并充分混懸，加入CD44＋抗體包被的超微磁珠混勻，安裝分離柱至磁場，以2mL緩沖液沖出陽性結合細胞，離 心 接 種 到 含 EGF（20×10－12g·L－1）、bFGF（20×10－12g·L－1）、LIF（10×10－12g·L－1）和b27（1×）的無血清1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中克隆球細胞貼壁分化增殖，將CD44＋標記為胃癌干細胞，對克隆球細胞行免疫熒光染色鑒定，染色陽性即為胃癌干細胞，將分離的干細胞制備成細胞懸液。

1.4 實驗分組 將分離所得的胃癌干細胞懸液隨機均分成干細胞初分組（胃癌干細胞懸液加入營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)）和激活組［胃癌干細胞懸液加入50μmol·L－1姜黃素（Nrf2激活劑）激活 Nrf2通路，繼續(xù)培養(yǎng)］。正常胃黏膜組織置于勻漿器中手工勻漿，制備10%正常胃黏膜組織勻漿，離心，取上清液，制備正常胃黏膜組織細胞懸液，加入營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，作為正常對照組。

1.5 Western blotting法檢測Nrf2和NQO1蛋白的表達水平 取上述各組細胞懸液加入裂解液提取蛋白，將提取的樣本蛋白變性后，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）后轉移至PVDF膜上，用新鮮配制的含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1h，然后將PVDF膜浸沒在Nrf2抗體（1∶500）、NQO1抗體（1∶500）溶液中，置于4℃冰箱中過夜，次日再將PVDF膜沖洗后浸沒在兔多克隆抗體（1∶1 000）溶液中，室溫孵育2h，采用BCL顯色法檢測PVDF膜上蛋白表達水平。1.6 SOD和MDA活性檢測 取各組細胞懸液，2 000r·min－1離心15min，取上清液，參照試劑盒說明書檢測SOD和MDA活性。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。Nrf2、NQO1表達水平和SOD、MDA活性以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 Nrf2和NQO1蛋白在胃癌干細胞及正常胃黏膜組織中的表達水平 干細胞初分組及激活組Nrf2和NQO1蛋白表達水平均顯著高于正常對照組（P＜0.05），干細胞激活組Nrf2和NQO1蛋白表達水平高于干細胞初分組（P＜0.01）。見表1和圖1。

表1 各組Nrf2和NQO1蛋白的表達水平Tab.1 Expression levels of Nrf2and NQO1proteins in various groups ［n＝30，±s，ρB／（mg·L－1）］

表1 各組Nrf2和NQO1蛋白的表達水平Tab.1 Expression levels of Nrf2and NQO1proteins in various groups ［n＝30，±s，ρB／（mg·L－1）］

＊P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.01 vs stem cells early group.

Group Nrf2 NQO1 Normal control 24.35±7.12 21.27±5.38 Stem cells early 41.09±5.31＊ 39.06±3.32＊Activiated 98.43±20.55＊△ 87.15±31.74＊△

圖1 Nrf2和NQO1蛋白在各組胃癌干細胞及正常胃黏膜組織中表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of Nrf2and NQO1 proteins in gastric cancer stem cells and normal gastric mucosa tissue in various groups

2.2 SOD和MDA在胃癌干細胞及正常胃黏膜組織的活性 干細胞初分組SOD活性顯著低于正常對照組 （P＜0.05），經(jīng)姜黃素激活后，SOD活性顯著增強 （P＜0.05），與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；干細胞初分組 MDA活性顯著高于正常對照組 （P＜0.05），但激活組MDA活性顯著降低 （P＜0.05），與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。見表2。

表2 SOD和MDA在胃癌干細胞及正常胃黏膜組織中的活性Tab.2 Activities of SOD and MDA in gastric cancer stem cells and normal gastric mucosa tissue （n＝30，±s）

表2 SOD和MDA在胃癌干細胞及正常胃黏膜組織中的活性Tab.2 Activities of SOD and MDA in gastric cancer stem cells and normal gastric mucosa tissue （n＝30，±s）

.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.01 vs stem cells early group.

Group SOD activity（U·mg－1 prot）MDA activity［cB／（μmol·L－1］Normal control 123.84±4.16 1.34±0.66 Stem cells early 73.82±2.07＊＊ 3.17±0.25＊Activiated 118.72±4.25△ 1.41±0.79△

3 討 論

腫瘤細胞在生長過程中持續(xù)經(jīng)歷著各種應激因素，使機體產(chǎn)生內源性應答反應即氧化應激，輕度氧化應激往往引起促進細胞存活、增殖、分化等適應性變化，重度氧化應激則造成細胞增殖阻滯、衰老、凋亡和壞死等損傷性變化［4］。氧化應激導致抗氧化類物質隨之升高，破壞了機體內氧化和抗氧化的平衡，致使組織細胞中自由基產(chǎn)生增多，從而導致了包括腫瘤在內的一些疾病的發(fā)生［5］。因此氧自由基及其促氧自由基生成的相關酶類的增加在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著一定作用［6－7］。MDA活性高低可反映脂質過氧化程度，而SOD的活性度則反映了細胞內主要抗氧化能力［8］。有文獻［9］報道：癌癥患者血漿中SOD的活性較健康人降低。涂宏蕾等［10］研究顯示：胃癌患者血漿中 MDA表達水平明顯升高。Nrf2是細胞防御氧化應激的重要轉錄因子，生理狀態(tài)下，Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1偶聯(lián)，錨合于胞質，處于活性相對抑制狀態(tài)。在細胞處于氧化應激狀態(tài)或有其他親核劑信號刺激時，Nrf2可與Keap1發(fā)生解偶聯(lián)，從而被激活轉入細胞核內，與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合，調節(jié)下游抗氧化酶基因NQO1的表達，從而增強細胞對氧化應激的耐受性［11］。研究［12］發(fā)現(xiàn)：抑制 Nrf2向細胞核易位會加重氧化應激，導致非諾貝特介導的肝癌的形成。Nrf2缺陷鼠比野生鼠更易形成肺轉移癌結節(jié)［13］。Nrf2激活劑——人工合成的咪唑啉三萜系衍生物能在肝、肺、腎、腸、腦、心臟、胸腺和唾液腺中，通過提高NQO1表達而對細胞起保護作用［14］。萊菔硫烷、姜黃素和奧替普拉等化合物均可誘導Nrf2下游基因NQO1、谷胱甘肽轉移酶（GST）和γ－谷氨酰半胱氨酸酶催化亞單位（GCLC）等基因表達，進而對幽門螺桿菌引起胃癌起到化學保護作用，減少腫瘤形成［15］。在缺血再灌注模型中，Nrf2激活劑CDDO－Me可以顯著增加抗氧化劑基因的表達［16］。

本研究結果顯示：Nrf2和NQO1蛋白在胃癌干細胞初分組中的表達水平高于正常對照組，提示由于胃癌發(fā)生了氧化應激反應，胃癌干細胞內Nrf2被激活，上調下游基因NQO1的表達，對細胞產(chǎn)生一定的保護作用；但與正常對照組比較，干細胞初分組的SOD的活性顯著降低，MDA異常升高，說明胃癌干細胞的SOD活性降低，產(chǎn)生了大量MDA，NQO1對細胞的保護作用不足以對抗該嚴重的過氧化損傷。而經(jīng)過Nrf2激活劑姜黃素干預胃癌干細胞后，Nrf2和NQO1蛋白表達增強，同時干細胞激活組SOD的活性顯著增強，MDA顯著下降，減輕了干細胞的氧化損傷。由此推測，Nrf2／NQO1信號通路在胃癌干細胞氧化應激反應中發(fā)揮了重要作用，激活該通路，可以誘導Nrf2的高表達，進而促進NQO1的表達，增強細胞對氧化應激的耐受性，起到保護細胞的作用。本研究結果為胃癌的干細胞治療提供了新思路。

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Mechanism of Nrf2／NQO1signal pathway in oxidative stress of gastric cancer stem cells

CHEN Hao1，XU Lang2
（1.Department of Gastrointestinal Surgery，Central Hospital，Jingzhou City，Hubei Province，Jingzhou 434100，China；2.Department of Pathology，School of Medical Science，University of Science and Technology，Wuhan 430065，China）

Objective To observe the expressions of nuclear factor E2－related factor 2（Nrf2）and NADPH quinine oxidoreductase（NQO1）in gastric cancer stem cells and normal gastric mucosa tissue，and to investigate the mechanism of Nrf2／NQO1signal pathway in oxidative stress of gastric cancer stem cells.Methods Tumor spheroids suspended separation method was used to select stem cells in 60gastric cancer tissue specimens.The stem cells were randomly divided into stem cells early group and activiated group.30cases of normal gastric mucosa tissues were regarded as normal control group.Western blotting method was applied to detect the expressions of Nrf2and NQO1protein in various groups.The activities of superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）were observed.Results Compared with normal control group，the expression levels of Nrf2and NQO1in stem cells early group and activated group were increased（P＜0.05），and the activity of SOD was decreased while the activity of MDA was increased significantly（P＜0.05）.Compared with stem cells early group，the expression levels of Nrf2and NQO1in activated group were remarkably increased（P＜0.05），and the activity of SOD was increased while the activity of MDA was decreased significantly（P＜0.05）.Conclusion Activating Nrf2／NQO1 signal pathway can adjust the activities of SOD and MDA in gastric mucosa tissue to enhance the tolerance of gastric mucosal cells against oxidative stress in order to protect the cells.

Nrf2／NQO1signal pathway；oxidative stress；gastric cancer stem cells；superoxide dismutase；malondialdehyde

R318.04

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0463－04

10.7694／jldxyxb20130308

2012－12－30

國家 “973”項目資助課題 （2011CB964700－G）

陳 浩 （1980－），男，湖北省仙桃市人，主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，主要從事胃腸外科的基礎與臨床研究。

許 浪 （Tel：027－68893395，E－mail：643025＠qq.com）